短链脂肪酸测定方法的研究进展

短链脂肪酸测定方法的研究进展

shortchaafa（scf）是1.6碳链中的有机脂肪酸，主要包括醋酸、丙酸、酰胺、异丙酸、戊酸、异戊酸、己酸和异己酸。其中，醋酸、丙酸和丁酸的总含量最高，约占短链脂肪酸的90%95%，由肠道细菌通过特定的碳分解产生。其他scf只有一个小部分（约5%），其中异丙酸和异戊酸钠等支链短链脂肪酸来源于蛋白质的分解。SCFA是结肠腔内重要的有机酸阴离子,通过离子或非离子形式被结肠粘膜吸收,是结肠和小肠上皮细胞的主要供能物质.临床研究表明,SCFA能较强地维护肠道形态及功能,并具有一定的治疗作用,通过测定生物基质中SCFA的水平可以整体诊断体内厌氧菌的变化,SCFA的含量也可以反映细菌活性.因此,SCFA的测定对营养、微生物和环境的研究有重要的意义.SCFA含量的早期测定方法是滴定法,该法特异性不强,准确度差.随着色谱技术的发展,气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)以及毛细管电泳(CE)已广泛用于SCFA的测定.但极性大、挥发性强和水溶性大的特点使SCFA难以定量,生物基质的复杂性也更增加了定量工作的难度.目前,原子吸收分光光度法、反相高效液相色谱技术也使用较多,方法也比较成熟.1测定短链脂肪酸1.1膜法检测血小板中脂肪酸的含量以气相色谱法测定人血、尿样中的短链脂肪酸,为临床提供一个快速、简便、精确的方法,以利于对糖尿病、脂肪肝、肝性脑病患者等疾病的诊疗效果观察.孙树英等采用10%改性聚乙二醇-20000内加1%磷酸固定液,克服了强极性、易缔合短链脂肪酸的拖尾现象,而且大大提高了分离度,获得了良好的分离结果.对标准液与处理尿样进行测定,结果正常人尿中主要含有乙酸和微量丙酸,当与正常人尿样色谱图呈现差异时,即被认为病理性尿,丙酸峰增大即为丙酸尿症.包娜然采用气相色谱法测定了血小板浓缩液和血清中的短链脂肪酸,所测短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、乳酸、丙酮酸和琥珀酸.血小板浓缩液中主要含有乙酸、乳酸、丙酮酸和珀琥酸,血清中含有乙酸、乳酸和丙酮酸,血清中未测到琥珀酸,血小板浓缩液中的琥珀酸可认为主要是血小板的内容物.血小板计数与乳酸含量成正相关关系.室温下取同体积不同处理时间的血小板浓缩液进行测定,随着保存时间的延长,乳酸含量增加,主要用于预防和治疗血小板减少或功能不良引起的出血,也可用于某些疾病的术前准备.肖殷等用气相色谱法对龈沟液中的短链脂肪酸(SCFA)进行检测并比较SCFA与临床牙周痛变程度间的关系,发现龈沟液中的乙酸、丁酸和异戊酸与牙周痛的严重程度间有较明显的关系,但不能反映正常人与龈点患者间的差别.丙酸能揭示龈史与正常者间的差别,而不能反映龈史与牙周史间的差别,只有异丁酸才能反映牙周组织在不同损伤程度之间的差别.因此对龈沟液中短链脂肪酸的整体检验,特别是异丁酸的浓度是反映牙周痛严重程度的较理想途径.孙晓红等用气相色谱-同位素比值质谱法测定体外肠道细菌发酵产生的短链脂肪酸,所测定的人体肠道发酵产生短链脂肪酸的能力不同,可能与乳糖不耐症状的发生有关,为乳糖不耐症状的发生提供依据.气相色谱法衍生化简单,仅需把羧酸衍生成酯,故目前许多实验室还在使用,但在实际工作中,由于短链和中链脂肪酸具有挥发和半挥发性质,在衍生化处理过程中,会因液-液萃取操作步骤多而损失,从而使中、短链游离脂肪酸(FFA)不能很好地定量.谭力等采用化学键合相FFAP毛细管柱定量分析人血清中FFA谱,样品无需衍生化直接进样,以庚酸(C7∶0)和正十七酸(C17∶0)为内标,用正己烷-异丙醇(4∶1,V/V)提取血清中FFA后直接进样.结果:除乙酸和丙酸外,其余脂肪酸的回收率在81.08%~118.29%.日内变异系数均小于8.95%,日间变异系数均小于8.47%,用各FFA与内标色谱峰面积的比值对浓度做标准曲线,在0.9925~0.9998.该方法简便可靠,符合生物样品的分析要求,可用于生物样品中FFA的测定.1.2scfa.n-pcr检测You等报道了9-(2-羟乙基)咔唑作为荧光试剂与脂肪酸在偶联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)腈胺和碱催化剂4-二甲基氨吡啶存在下反应,产物无需再提取,用乙腈稀释后直接进入液相色谱体系分离检测.该法可同时分析C1~C20脂肪酸,产物稳定,灵敏度高.有时也可不经衍生化而直接采用HPLC法测定SCFA.Stein等用HPLC紫外(UV)检测法测定了生物样品如结肠组织、粪便、唾液、十二指肠液、尿和血浆中的SCFA.样品以2-2-二甲基丁酯为内标,通过真空蒸馏和在碱性条件下冻干浓缩后,在磺酸基聚苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱上分离,所得结果与GC所得结果相似.Horspool等用离子交换柱进行分离,采用UV检测器在210nm波长下测定了马盲肠液中的7种SCFA.ChenHM等用ORH-801有机酸柱分离粪便中C2~C5的直链和支链SCFA,用电导检测器进行检测.与紫外检测比较,电导检测更适用于SCFA的检测.离子色谱法是分析细菌终末代谢酸的有效方法.其中离子排斥色谱法使用较多,方法也较成熟.张萍等用反相梯度高效液相色谱(RP-HPLC)紫外检测器,分析了甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、琥珀酸、戊酸7种短链脂肪酸,为使用该方法检测细菌的终末代谢酸打下了良好的基础.1.3间接ce-lif法CE分离测定SCFA的方法有胶束电动毛细管色谱(MEKC)、等速电泳(CIEF)和毛细管区带电泳(CZE).间接和直接毛细管电泳-紫外检测法(CE-UV)都曾被用来测定SCFA,其中间接CE-UV法因可对SCFA进行快速有效地分离而被广泛应用.用磷酸缓冲液(pH6.0)、甲醇作为改良剂可直接分离并在波长200nm下检测尿中包括SCFA在内的多种有机酸.AreUano等应用间接CE-UV法分析了厌氧菌中的SCFA.该法使用无涂层毛细管柱,以10mmol/L的苯甲酸和组氨酸溶液(pH6.0)为背景电解质,1mmol/L十四烷基三甲基溴化铵为电渗流改性剂,在波长220nm下,测定了厌氧菌中11种SCFA.但方法的灵敏度较低,11种SCFA的检测限从0.02mg/L到2.75mg/L.Chi等在Tris缓冲液中加入p-茴香酸盐(pH8.0),利用C3~C6的SCFA的检测来确定猪肥料气味产生程度.Desbene等用荧光素钠盐为背景信号发光器,5mmol/L硼酸盐(pH9.2)-乙醇(60∶40,体积比)或者5mmol/L硼酸盐(pH9.2)(含0.2mmol/L己二醇单正十二烷基醚)缓冲液作为电解质,应用间接CE-LIF进行检测,灵敏度稍有提高,对于每种酸(C6~C15)的检测灵敏度均约为5×10-6mol/L.经过衍生化的SCFA用直接CE-LIF法测定灵敏度可达10mol/L,但分离效果和范围不及间接CE-UV分析方法.使用衍生化试剂NBD-PZ-NH2,可使灵敏度达到6.5nmol/L.CE法还是最简单且自动化程度最高的分离对映体的方法.一般通过构建手性分离环境来分离对映体,如使用手性添加剂、使用填充毛细管柱或使用手性涂层毛细管柱.而对于样品几乎无需前处理,样品用量也很少.用环糊精衍生剂和改性冠醚作为手性选择剂可分离手性SCFA,如D-,L-乳酸.Kodama等用2-羟基丙基-β-环糊精(2-HP-β-CD)为手性选择剂,聚丙烯酰胺涂层毛细管(50mmi.d×50cm),分离电压20kV,90mmol/L磷酸缓冲液(pH6),在200nm处检测了食品中的乳酸对映体.Saavedra等用该体系并经优化和改进后应用到生物样品,测定了尿液、羊水和脑脊液中的D-,L-乳酸.Tan等采用无涂层毛细管柱,在缓冲液中加入十四烷基三甲基溴化铵产生动态涂层,以2-HP-β-CD为手性选择剂分析了大鼠和人血浆中的D-,L-乳酸.多种抗生素如利托菌素A也是很好的手性选择剂,并被应用到CE-UV法分离检测乳酸对映体.通常CE-UV能较好地分离较大范围的脂肪酸,但该方法灵敏度较低;虽然CE-LIF提高了灵敏度,但分离范围窄.这是因荧光试剂的质量大和荧光衍生化试剂的反应活性等问题引起的.例如,Zuriguel等用间接CE-UV法成功地分离了C5~C18的脂肪酸,但灵敏度极低,而脂肪酸经5-BMF衍生化后用CE-LIF测定,灵敏度得到大大提高,但只能分离C8~C11的脂肪酸.因此,最佳衍生化试剂的寻找是进行CE-LIF分析的一个难点.1.4ffa法与其他法刘忠英等研究用原子吸收分光光度法间接测定生物样品中游离脂肪酸(FFA)的方法,用氯仿-正己烷-甲醇混合液萃取样品中FFA,用铜溶液与FFA形成“铜皂”,进入有机相.未反应的Cu2+进入水相,用原子吸收法测定有机相中铜,间接求得游离脂肪酸含量.该法线性范围为10~100nmol,对血浆测定结果的相对标准偏差为小于6.59,回收率为96%~102%.测定结果与比色法的结果基本一致.利用这种方法测定FFA较其它方法简便、快速,适合大批生物样品的测定.2关于短链脂肪酸的应用研究2.1影响scfa的因素短链脂肪酸是消化道细菌酵解日粮粗纤维的主要产物,其种类与数量受细菌数量、pH、酵解底物、发酵基质的数量、类型、降解速率、降解程度及肠道菌群、宿主生理状态和日粮添加剂等因素的影响.细菌数多,SCFA产生多,pH为7时产生的SCFA最多,不同酵解底物生成的SCFA总量和比例不同.2.1.1胞内二氧化碳h+非离子化酸的吸收可促Na-H交换,刺激Na+吸收;丁酸还可通过产能提供ATP增加细胞内二氧化碳浓度,经碳酸酐酶作用产生H+而促进Na-H交换;Na+的吸收又刺激了离子形式SCFA的吸收.结肠黏膜上皮细胞对Na+吸收增加,继之增加水的吸收量.抗生素可抑制微生物生长繁殖,减少SCFA生成,引起水、钠吸收降低,可导致与抗生素相关的腹泻.2.1.2scfa的产生SCFA是重要的能源底物,它在反刍动物体内最基本的作用是供应能量.瘤胃内生成的SCFA75%被瘤胃上皮细胞吸收,其余被消化道其它部位吸收,这些被吸收的SCFA主要作用是给动物提供能量.SCFA作为结肠的首选代谢性燃料,提供结肠黏膜总需能量的70%,该能量来自细菌发酵产物.通过对混合SCFA产生的CO2的研究,发现细胞作用的顺序是丁酸第一,丙酸次之,然后是乙酸.SCFA代谢生成CO2和酮体,它们是粘膜脂类合成的前体.2.1.3scfa对结肠微动脉的影响通过离体结肠研究发现,单独应用SCFA的任一种或混合应用,对结肠中微动脉有明显的浓度依赖性扩张作用,这表明,SCFA能改善结肠微循环,对结肠黏膜产生营养作用.SCFA对回肠末端微循环也有一定影响,且在质量上和对结肠血流量影响的作用相似.2.1.4不同途径输注scfa,对具体消费罪犯血浆胃动素的影响SCFA能刺激胃肠激素分泌.胃泌素是由胃窦和小肠上部的G细胞分泌的一种胃肠道激素,具有促进胃酸分泌、胃窦收缩和消化道黏膜生长等生理作用.王星所等用3种短链脂肪酸盐(乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠)溶液灌注皱胃,观察其对山羊血清胃泌素水平的影响,结果表明,灌注前后差异显著.SCFA在改变瘤胃内容物pH的同时,刺激皱胃窦部,引起血浆胃泌素释放增加.胃动素是一种脑肠肽,与胃运动的生理调控有关,是饥饿狗胃运动强有力的刺激物.对禁食狗静脉注射胃动素可引起胃及十二指肠强烈收缩,促进狗胃内流体食物的排空.胃动素可刺激狗胃蛋白酶分泌,并增大胃黏膜的血流量.胃动素还可刺激胰液分泌和引起体胆囊的收缩.李祥等用2只装有瘤胃瘘管和皱胃瘘管的本地健康空怀母山羊做自身对照试验,禁食24h后,在试验1期从瘤胃瘘管分4次分别输注乙酸、丙酸、丁酸和生理盐水;试验2期从皱胃瘘管重复上述操作,每次都从颈静脉套管采血,用放射免疫法测定血浆胃动素含量.结果表明,输注SCFA可提高山羊血浆胃动素水平;瘤胃内输注乙酸、丙酸和丁酸后的血浆胃动素水平升高,与对照组相比差异均极显著;皱胃内输注丙酸或丁酸后,血浆胃动素水平显著高于对照组,输注生理盐水对山羊血浆胃动素水平影响不大.另外,静脉输入SCFA还可直接刺激胰腺腺泡的分泌,增加胰高血糖素和胰岛素的分泌,其作用强弱依赖于SCFA的剂量.2.2短链脂肪酸治疗肠道外科的临床应用SCFA是肠道中抑制病原微生物的重要因素.当肠道中SCFA浓度升高时可抑制沙门菌等病原微生物的生长,抑制能力与pH有关,而肠道pH又与SCFA多少有关.秦泽荣等研究发现,盲肠SCFA下降是导致沙门菌感染的原因之一.细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡的过程,受多种基因产物控制.丁酸可促进体外培养的结肠癌细胞凋亡.丁酸对细胞凋亡的作用是其它SCFA所没有的.对不同细胞系,丁酸诱导其凋亡的机制不同.另外,耿珊珊研究发现,丁酸还可影响多种原癌基因的表达,其在毫摩尔浓度下就能发挥抑制肿癌细胞增殖、诱导分化和凋亡作用,影响原癌基因表达,改善细胞的恶性生物学行为,降低细胞恶性程度.2.2.1促进肠细胞增殖SAKripke等往大鼠结肠灌注乙酸、丙酸和丁酸的混合液,能增加空肠和近端结肠黏膜DNA含量,刺激肠上皮细胞增殖.其中丁酸对结肠上皮细胞增殖和黏膜生长起主要作用,其次是丙酸,乙酸最弱.结肠内灌注丁酸能促进黏膜生长,表现为黏膜总量、DNA含量和有丝分裂指数增加,减少促炎因子生成.在正常大鼠结肠体内研究也发现,丁酸降低隐窝表面的高度增殖.2.2.2SCFA在肠道外科中的应用由于SCFA能改善肠道微循环、促进肠道细胞增殖和黏膜生长,因而在肠道外科中应用甚广.自从l980年澳大利亚Roediger博士根据实验结果提出溃疡性结肠炎(UC)是由于结肠上皮短链脂肪酸(SCFA)利用障碍而导致的种上皮“饥饿性病变”以来,引起了人们对短链脂肪酸与溃疡性结肠炎关系的重视.近年来的研究表明,应用短链脂肪酸可改善转流性结肠炎、远段溃癌性结腑史、袋囊炎、放射性结肠炎的临床症状、内镜和组织学表现.SCFA能增加肠道吻合的强度.证实添加拧檬果胶能促进化学性结肠炎模型的愈合,能明显增加实验性动物肠吻合口强度,促进愈合.把SCFA注入大鼠结肠腔内,其破裂压与肠壁张力明显高于电解质灌注组和非灌注组,证实了SCFA对肠吻合有促进作用.可能机制是,SCFA刺激结肠黏膜上皮细胞增殖,肠吻合口上皮细胞形成加速,胶原溶解速度减慢;脯氨酸与赖氨酸是胶原纤维交织和稳固所必需的,其羟化需氧参与,SCFA特别是乙酸促进肠血流和氧的摄取,促进胶原的成熟.然而静脉补充SCFA并没有增加肠吻合口的破裂压与肠壁张力等机械强度,也未提高羟脯氨酸的含量,可能因为结肠血流量只占心输出量的8%~9%,与腔内灌注相同剂量的SCFA用于静脉内,到结肠的量只是灌注时的1/10,不足以促进吻合.1989年,Haring等首先成功地用短链脂肪酸瘫肠法治疗转流性结肠炎,Mortensen等的实验也证实了短链脂肪酸瘫肠有舒张结肠血管和营养作用.但GuillemotlH和Allan等运用短链脂肪酸或丁酸钠瘫肠未见明显效果.Breuer、Patz、Steinhar多数学者认为短链脂肪酸治疗远段溃疡性结肠炎教果良好,值得临床推广.李可洲等研究表明,短链脂肪酸(SCFA)对大鼠移植小肠萎缩及功能具有预防作用,短链脂肪酸能维持大鼠移植小肠粘膜形态,减轻移植肠上皮细胞超微结构损伤,并能改善移植肠对氨基酸的吸收能力.2.2.3SCFA抑制肿瘤的作用由于参与机体的氧化供能,SCFA能促进正常细胞的生长,而在肿瘤细胞,SCFA则具有抑制细胞生长、诱导细胞分化和促进细胞凋亡的作用.在结肠癌、肝癌、膀胱癌、胶质瘤等诸多肿瘤的体外实验中,丁酸的处理使细胞周期素依赖激酶抑制剂p21表达增强,细胞周期由暂时脱离细胞分裂期的时期(GO期)到DNA合成期(S期)过渡受阻;肿瘤细胞形态结构趋于正常,呈现明显分化趋势;丁酸还调控Beb2凋亡基因家族,激活Caspase级联放大反应,破坏线粒体跨膜电位,诱导肿瘤细胞凋亡增加.除此以外,丁酸还能抗肿瘤新生血管形成;阻滞肿瘤细胞与基膜的粘连;减少肿瘤细胞分泌尿纤溶酶原激活物,从而减少细胞外基质的破坏,抑制肿瘤细胞的浸润侵袭,显示了多方位的抗肿瘤效能和广泛的应用前景.近年来,有大量的研究表明,SCFA引起的这些效应与组蛋白的乙酰化有关.而在白血病、肺癌、胶质瘤等其它肿瘤疾病中