小鼠便秘模型建模方法的初步探讨

小鼠便秘模型建模方法的初步探讨

抗教学药物的研发滞后便秘是临床上常见的症状，指大便隐匿于肠道超过48小时的大便，大便中的水分流失过多，粪便失去过多，大便结构干燥，狭窄的肛门管容易穿越肛门，运输时间延长，排便次数减少，因此很难立即排便。通常，3.5天或更长时间。我国慢性便秘发病率高达20%,约有50%~60%的人曾经受到便秘的困扰,以老年人、妇女及儿童最常见。便秘时,宿便堆积在肠道里,不断产生各种毒气、毒素,造成肠内环境恶化、肠胃功能紊乱、内分泌失调、新陈代谢紊乱等,严重影响人们的生活质量。便秘不仅成为肛肠病发病的诱因,还可加重许多全身性疾病。而目前,抗便秘药物的研发仍显得比较滞后,便秘动物模型的建立明显不足,缺乏对药物作用机理的深入研究。因此,确立一种简单、高效并且与人类便秘特征较为相似的动物模型迫在眉睫。本研究参考了相关文献,对四种小鼠便秘模型的建立方法进行了比较,旨在找到更加简单易行、高效的便秘造模方法,为便秘治疗药物的研发提供实验基础。1材料和方法1.1实验动物及饲养雄性昆明纯种小白鼠40只,体重18~22g,由大连医科大学实验动物中心提供(清洁级),均自由饮水、进食,饲养室温(22±2)℃。1.2药品、试剂和仪器复方地芬诺酯片:每片含盐酸地芬诺酯2.5mg、硫酸阿托品25μg,长春长红制药有限公司生产,批号:22022037,临用前配制成所需浓度的复方地芬诺酯混悬液;北海硫糖铝咀嚼片0.25g*100片,北海阳光药业有限公司生产,批号:45021553;阿拉伯树胶粉由成都科龙化工试剂厂进口分装,批号:20030106;活性炭(粉末)北京木材加工厂生产;炭粉液(墨汁,首粒黑便指示剂)的配制:准确称取阿拉伯树胶100g,加水400ml配成0.25%透明溶液,再将活性碳粉50g加至上述溶液中煮沸3次,待溶液冷却后加水定容至500mL,于4℃冰箱保存,临用前摇匀,并加入等量蒸馏水,制得碳粉液(墨汁)待用。1.3实验方法1.3.1动物的单次给药和人工联合灌胃10只小鼠随机分为复方地芬诺酯组(8只)和阴性对照组(2只)。实验前1天记录10只动物首粒排黑便时间和在2h内排便的粒数及重量,并将各组小鼠禁食不禁水16h,于次日测定时,模型组给予复方地芬诺酯混悬液(5mg/kg)灌胃,阴性对照组给予等容量蒸馏水;30min后再给碳粉液指示剂,动物单笼喂养,正常饮水和进食,从灌墨汁开始记录每只动物首粒排黑便时间和在2h内排粪便的粒数及重量。1.3.2单次饮水方式10只小鼠随机分为禁水不禁食组(8只)和阴性对照组(2只)。试验前1天记录小鼠首粒排黑便时间和在2h内排便的粒数及重量,限制水量:于第一、二天分别给予前五日平均水量的1/6,第三至六日给1/3,取整数值。给水方法:对限水小鼠采用普通饮水瓶手持辅助饮水的方法。每天分两次给水,间隔12小时,分别给予一日水量的1/3和2/3,间断饮尽。30min后再给炭粉液指示剂,动物单笼喂养,从灌墨汁开始记录每只动物首粒排黑便时间和在2h内排粪便的粒数及重量。1.3.3便时间及排气10只小鼠随机分为硫糖铝组(8只)和阴性对照组(2只)。试验前1天记录20只动物首粒排黑便时间和在2h内排便的粒数及重量。给药方法:将硫糖铝配制成质量浓度为0.5g/L的溶液,每天按1mL/只灌胃小鼠1次,连续2d,第3天剂量减半,30min后再给炭粉液指示剂,动物单笼喂养,正常饮水和进食,从灌墨汁开始记录每只动物首粒排黑便时间和在2h内排便的粒数及重量。1.3.4灌墨汁添加量的确定10只小鼠随机分为禁水不禁食(8只)和阴性对照组(2只)。实验前1天记录每只动物首粒排黑便时间和在2h内排便的粒数及重量,连续给0℃冰水混合物7天后给炭粉液指示剂,动物单笼喂养,正常饮水和进食,从灌墨汁开始记录每只动物首粒排黑便时间和在2h内排便的粒数及重量。1.4统计学分析计量资料数据用均数±标准差(ue0af±s)表示,SPSS10.0统计软件分析,采用单因素方差分析,用SNK-q检验进行两两比较,P<0.05为差异有统计学意义。2小鼠肝胰腺保乳手术后两期排放检查如表1、图1、图2、图3所示,与正常对照组比较,灌胃复方地芬诺酯、禁水不禁食、硫糖铝及冰水法四种造模方法均可使小鼠首粒黑便排便时间显著延长、2小时内排便粒数及排便重量显著减少(P<0.05)。但采用复方地芬诺酯、禁水不禁食法处理的小鼠较经口灌胃胃肠运动抑制剂硫糖铝及经口灌胃冰水诱导的小鼠首粒黑便排便时间显著延长、2小时内排便粒数及排便重量亦显著减少(P<0.01)。3小鼠脏器长期排胃的一般资料,缺乏基于复方地芬诺酯的小鼠都已进入前状态小鼠是复制便秘模型的常用动物,目前建立小鼠便秘模型主要依据某些中医理论和现代医学方法进行,小鼠便秘模型有寒积型便秘、实热型便秘、失水燥结型便秘、阴虚血瘀型便秘、脾虚型便秘和药物型,每一种便秘模型均在不同程度上模拟了临床便秘的某些特征表现。禁水不禁食法基于失水燥结型便秘原理,是目前便秘实验研究中应用较多的一种,制备简便,成功率高,但模型小鼠有时会出现无粪便现象。鄢顺琴根据寒积中阻致腑气不通的中医理论,应用冰水建立了寒积型便秘模型,该模型复制简单,但应注意冰水的温度等。药物型主要应用硫糖铝、复方地芬诺酯及吗啡建立小鼠便秘模型。许绍衡曾应用硫糖铝复制了便秘模型,该法适用于泻下药物药效的研究。本研究通过四种不同的方法建立了小鼠便秘模型。复方地芬诺酯是常用的止泻剂,主要通过直接作用于肠道平滑肌,抑制肠黏膜感受器,消除局部肠黏膜的蠕动反射而使肠道蠕动减慢,使肠内容物通过延迟,致使小鼠排便减少或难排便,与便秘的临床症状相似。本实验将小鼠禁食后,采用复方地芬诺酯一次性灌胃小鼠建立便秘模型,使小鼠首粒排便时间明显延长,2h便粒数和便重量较正常小鼠显著减少,此结果也与文献报道一致。该模型属于非特异性便秘模型,采用一次性给药,不影响动物的生理功能。通过禁水不禁食的方法诱导小鼠后,第二天即可观察到小鼠出现便秘的症状,粪便干燥如豌豆样圆珠状表现,小鼠首粒排便时间延长,便粒和便量显著减少,表明限水是较强的实验性便秘因素,该法可用于制作小鼠便秘模型。但与复方地芬诺酯造模相比,禁水不禁食造模不如复方地芬诺酯造模操作简易和效果显著。硫糖铝可附着在胃肠粘膜表面,使胃肠道内液体减少。采用硫糖铝灌胃处理小鼠也使小鼠首粒排便时间延长,便粒和便量减少,但其效果明显不如复方地芬诺酯灌胃和禁水不禁食的造模效果显著。采用0℃~4℃的冰水造模,需要连续观察14天,实验用冰水简单易得,也可使小鼠首粒排便时间延长,2h便粒和便量减少,但效果亦不如复方地芬诺酯灌胃和禁水不禁食造模效果明显,且实验周期较长。小鼠有随时排便的习性,小鼠体重差别较大或食用不同饲料时粪粒形状不同,成年小鼠正常便为长粒状(短棒状),多单粒排出,部分粪粒可2~3粒挤压在一起排出。笼底如有水、尿时粪便可不成形、或与垫料粘在一起,使得排便粒数和排便重量出现误差,实验中应尽量避免,保证结果的可靠性。食物与食量是影响大便量的基本因素之一,本实验采用干燥的标准饲料,但对于限水小鼠来说,干燥的饲料使其吞咽困难,表现在小鼠多在给水后才开始进食,因而食