代谢组学的研究与应用

代谢组学的研究与应用

代谢组学是研究生物内源性代谢物质的类型、数量和内外因素的学科。这是系统生物学的重要组成部分。20世纪90年代末,Nicholson首次提出“metabonomics”概念,它的含义是“定量测定生物系统对病理生理刺激以及基因改变产生的多参数代谢的动态应答”。随后,Fiehn又首次提出“metabolomics”概念,将代谢组学定义为定性定量测定特定限定条件下生物样品中的总体代谢谱。随着这项学科研究的发展,现在科学家们认为代谢组学(metabonomics/metabolomics)是对某一生物或细胞内所有低分子质量(MW<1000)的代谢物质进行定性和定量分析,将在内外因素作用下产生的代谢物质的动态变化与病理生理相关联。代谢组学的研究对象是生物体内小分子代谢物总和的代谢组,它们是基因表达和代谢产生的中间产物或最终产物。代谢组学处于生命信息传递的终端,它能表现出生物体系整体功能或状态的最终结果,并且与基因组学、转录组学和蛋白质组学共同构成系统生物学整体。代谢组学具有代谢物种类远小于基因蛋白的种类数、代谢物易被检测、各个生物体系研究手段与技术通用等优点。随着分析技术的不断发展完善和数据处理方法的不断优化创新,代谢组学的研究范围涉及微生物学、植物学、食品及营养科学、毒理学研究、临床疾病诊断、药物开发等诸多研究领域。本文将对代谢组学研究的流程及其相关的分析技术的进展进行介绍。1代谢组研究流程代谢组学研究流程一般包括生物样品的采集,样品预处理,数据的采集、分析和解释等。分析技术和数据处理方法构成其主要研究平台。1.1样本的采集和处理代谢组学的研究对象通常是生物样本,一般有生物体液(如血液、尿液、唾液和脑脊液等)、细胞提取物、细胞培养液、组织提取液以及粪便等。实验设计中应充分考虑样品收集的种类、部位、时间、样本群体等因素。在研究人类样本时,还需要考虑组间性别、种族、年龄、体重、饮食习惯和地域等因素。在处理生物样本时要避免样本受残留酶活性或氧化还原反应等的影响。一般需要对所收集的样品进行快速猝灭,如采集之后立即进行液氮冷冻、酸处理等。1.2预处理方法的选择生物样品预处理应该根据不同的化合物选择不同的提取方法,并对提取条件进行优化,除去干扰杂质,将样品转化为适合测定的物质形式,以提高仪器检测时的灵敏度和选择性。常用的预处理方法有固相萃取、固相微萃取、亲和色谱等。代谢组学研究在提取和预处理样品的操作过程中,应尽可能保留和体现样品中代谢物组分的完整信息。1.3代谢组学研究目前代谢组学研究中数据采集最常用的分析技术包括核磁共振(NMR)、气质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS),并且多种分析技术联用进行代谢组学研究已成为当今的研究趋势。1.4生物代谢的关键环节代谢组学数据信息处理与分析是代谢组学研究的关键环节,其一般包括数据预处理、模式识别与模型评价、生物标记物筛选与鉴定、代谢物生物功能解释和代谢通路分析等步骤。1.4.1色谱-质谱联用技术的实现过程原始数据需要经过预处理,以保留与分类有关的信息,消除实验过程和分析过程中多余干扰因素的影响。不同分析技术有各自不同的数据预处理方式。色谱-质谱联用技术的原始数据信息主要是离子的保留时间、质核比和峰面积,这些原始数据需要经过归一化、标度化、滤噪和色谱峰对齐等步骤。这些操作可采用XCMS、Markerlynx等软件完成。针对NMR数据的预处理主要包括消除噪声和谱峰化学位移漂移、分段积分、归一化、标度化等步骤,用于预处理NMR数据的软件主要有MestreNova、XwinNMR、Automics和MDAS等。1.4.3结构鉴定和数据库构建医药学研究中代谢组学常常需要对疾病发病机制或药物治疗相关的代谢标志物进行研究,常用的分析方法有PCA等模式识别方法、t检验和方差分析等。以上多元统计分析和单变量统计分析相结合,可以提高筛选差异变量的准确性和可信度。筛选出的差异变量需要经过结构鉴定,代谢物数据库提高了代谢物鉴定效率,但是目前代谢组学研究尚无功能完备的数据库。对LC-MS分析获得的生物标志物的定性方法还主要依靠与标准品的比对来判定;NMR和GC-MS分析需要经过各自相关的数据库匹配,如ChenomxNMRSuite、NIST、FiehnGC-MSDatabase;现阶段,对以上分析手段也常用一些生化数据库或者相关的文献报道进行未知代谢物的结构鉴定。1.4.4与基因组教学信息相关的疾病资料一些生化数据库可以用于已知代谢物的生物功能解释,如京都基因与基因组百科全书(KEGG)、METLIN、人体代谢组数据库(HMDB)等。通过Metaboanalyst等软件可以得到目标代谢通路,阐述病理生理、药物作用等相关机制。1.5肺炎产物代谢组学研究代谢组学单独使用不能全面的反映系统生物学的信息,将其与基因组学、转录组学、蛋白质组学的结果整合在一起,才能更全面深刻地阐明生物网络的复杂性。Maier等将代谢组学分析和定量的基因组学及蛋白组学相结合对肺炎支原体进行研究,发现肺炎支原体的代谢途径是通过功能单元来调控的。尽管存在技术限制、样品复杂性及缺乏配套的数据处理等限制,此研究是组学间的整合思想的成功应用。Connor等对2型糖尿病进行研究时,对db/db小鼠尿液采用NMR技术进行代谢组学研究,对其肝脏、脂肪和肌肉进行转录组学研究。将代谢和基因表达的变化综合分析后发现在糖尿病模型中有24个不同的途径被改变,其对2型糖尿病的临床研究和临床诊断及筛选治疗药物方面具有重要意义。2测定对象适的方法进行测定预处理后,样品中的代谢产物需要通过合适的方法进行测定。主要的分析技术如NMR、色谱、MS等分离分析技术及多种分析平台的联用在代谢组学研究中都得到了广泛应用。2.1nmr的动态范围和应用NMR方法有如下优点:预处理简单;样品用量少,无损伤性;可测出的信息量大,对所有化合物的灵敏度是一样的。尤其是NMR的氢谱对含氢化合物都有响应,可以检测到大多数的化合物,得到丰富的样品信息。但是在NMR方法中由于代谢物的分子小,内源性物质多,许多化合物的峰相互重叠、干扰,使生物标志物常常受到不相干物质的干扰;测量的动态范围窄;同时,谱线展宽造成灵敏度相对较低。高分辨率的NMR可以解决灵敏度低的缺陷,使图谱容易解析。Rai等代谢分析采用高分辨率NMR分析正常人、急性呼吸窘迫综合征和急性肺损伤患者的支气管肺泡灌洗液,用PCA和PLS-DA鉴别3组肺泡灌洗液的代谢谱和肺损伤相关的生物标记物,描述人类肺损伤的程度。碳谱及各种二维NMR技术相配合也可以提供大量的结构信息,降低了不相干物质造成的干扰。新的脉冲实验技术也可以提高NMR的分辨率和灵敏度。魔角旋转核磁技术(MAS)消除了由于偶极耦合引起的谱线展宽和化学位移的各向异性。近年来新发展的高分辨魔角旋转(HR-MAS)NMR技术,又使得样品可以不进行预处理,直接测定。Jiménez等采用1HHR-MASNMR光谱分析了直肠癌的肿瘤组织及其相连的肠黏膜,确定了改变它们代谢的共同特征及可以用于诊断、分期肿瘤的生物标志物,并且发现和肿瘤相连的肠黏膜的代谢改变状况比肿瘤组织有更强预测能力,帮助生成新的诊断和预后的方法。NMR技术的成熟和发展拓宽了其应用领域,广泛应用于药物毒性、生理病理过程机制研究、疾病的临床诊断。2.2色谱-色谱联合技术与NMR相比,色谱-质谱联用技术具有检测分离模式多样、变量与代谢物直接相关等优势,逐渐成为代谢组学研究中最主要的分析工具之一。2.2.1gc-ms检测气相色谱(GC)是一项成熟的分析技术,GC的高效分离结合MS的结构鉴定功能,使GC-MS具有高精密度、灵敏度及耐用性,成为代谢组学研究的重要平台之一。它与LC-MS相比,优势在于可从标准谱图库中获得化合物结构信息,易对代谢物进行定性。不足之处为对于不挥发性组分如生物体系中极性比较大的糖类、氨基酸等成分的分析,需要进行衍生化才能得到较多的代谢组分信息。如Zeng等采用GC-MS来检测正常体重、超重和肥胖儿童的血浆样本,通过分析代谢指纹图谱发现这3组样本的代谢模式是不同的,经过更进一步的非相关线性判别分析和典型相关分析发现了与肥胖相关的潜在生物标志物。在微生物代谢组学研究中,Kondo等使用GC-TOF/MS并结合PCA和OPLS-DA的方法对检测到的酵母菌代谢物进行分析,从而来区分酵母菌在不同生长阶段的代谢变化。在分析有干扰的复杂样品时,全二维气相色谱峰容量高、专一性强、分离效果好,其高灵敏度和聚焦效果能显著增加代谢物的检出量。全二维气相色谱-飞行时间质谱(GC×GC-TOF/MS)在代谢组学中应用前景广阔,适合于复杂样品的分离分析。Hantao等运用GC×GC-TOF/MS对先天性新陈代谢异常患者尿液中的有机酸进行了分析,结果发现某些特定的有机酸(如巴豆酰甘氨酸等)可以作为这种疾病诊断的标志物,并且证明了GC×GC-TOF/MS用来定量分析的有效性。Li等采用GC×GC-TOF/MS并结合模式识别方法分析了糖尿病患者和健康人的血浆样本,最终鉴定了葡萄糖、2-羟基异丁酸、亚油酸、棕榈酸和磷酸5个潜在的生物标志物,表明了GC×GC-TOF/MS技术在代谢组学研究中的实用性和优越性。2.2.2代谢组学研究可采用lc-ms和pca方法进行分析高效液相色谱(HPLC)对待测组分的挥发性和热稳定性没有要求,不需繁琐的衍生化步骤,样品前处理简单,检测温度低,分离物质快速、高效,与MS高灵敏度、高专属性的优点结合,具有提纯和制备单一物质的能力,是目前代谢组学研究中最常用的分析技术。HPLC有正相(NP)、反相(RP)、亲水性相互作用(HILIC)和离子交换(IEC)等多种色谱分离模式。根据化合物的不同极性,选择相应的HPLC操作模式,可以提高对样品的灵敏度和选择性。如广泛应用于代谢组学研究中的HILIC适用于分析复杂样品中的极性物质。Gika等利用UPLC-MS和HILIC-MS技术对26例脂肪肝患者的肝组织进行代谢组学分析,利用多元统计分析对数据进行分析,发现了和脂肪肝相关的生物标志物,反映了脂肪肝患者肝组织的综合代谢轮廓以及导致肝损伤的代谢改变。LC-MS技术主要应用于临床疾病诊断,部分疾病的生物标记物的发现等研究,它具有高通量筛选功能,通过对代谢物结构的鉴定,可以对样本进行针对性和细致的分析。LC-MS虽然缺少可以参考的标准谱图数据库,但可以通过它获得代谢物精确的分子质量数,在通过数据库进行检测确定分子的结构信息。LC-MS分析的缺点是共流出峰间的离子抑制/诱导作用、基质效应等问题。随着液相和质谱技术的发展,UPLC-MS技术,LC-MS/MS等技术也被应用到代谢组学研究上。(1)UPLC-MS技术:超高效液相色谱(UPLC)是一种新型LC技术,具有高通量、高分离能力、高灵敏度和专属性等优势,和质谱联用时基质干扰减少,改善极端复杂的样品的分离状况。已经在代谢组学的各领域得到广泛应用。Gika等使用UPLC-TOF/MS的方法分别分析酒精处理的大鼠和小鼠与对照动物的血浆和尿液样本,研究酒精中毒导致的显著肝损伤水平,采用主成分分析的方法找到了相关的差异代谢物。Lu等基于UPLC/MS的方法和使用PCA进行比较来研究骨碎补对“肾阳虚证”大鼠随时间变化的恢复效果,并且鉴定了一些有显著性差异的代谢物,这有助于进一步了解“肾阳虚证”和骨碎补对其的治疗机制。(2)LC-MS/MS技术:经分离检测的代谢物需要进一步定性定量,LC-MS/MS分析可以满足一般定量的分析精度要求,具有良好的重现性和线性范围。高选择性、高灵敏度的MS/MS可以通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描,发现并突出目标化合物,显著提高信噪比。这些特性使LC-MS/MS在代谢组学研究中获得了广泛使用。Gonzalez等基于UPLC-TOFMS/MS研究大鼠血清样本,鉴定了与肝功能损害相关的生物标志物,定量分析了肝损伤程度,与组织病理分析结果一致。Fernandez等基于固相萃取液相色谱-多级质谱(SPELC-MS/MS)分析冠心病患者血清中的类花生酸类物质,该方法具有高度选择性和高灵敏度,取得显著成效。2.2.3ce-ms检测CE-MS将毛细管电泳(CE)的快速、高效、分辨率高、高溶解性、重复性好等优点和MS分析的灵敏度高、速度快等优点相结合。在一次分析中可同时得到迁移时间、分子量和碎片特征信息。在生物样品研究中,微生物等生物体的代谢物很多是极性物质,CE-MS常用于分析其中的离子性化合物。CE-MS的接口技术是影响整个检测的关键因素之一,随着接口技术的发展,CE-MS成为化学药物研究、临床诊断以及法医学等的有力工具。Naz等利用毛细管电泳-飞行时间质谱(CE-TOF/MS)分析经超滤法预处理的大鼠血清样本,发现并证实了一些代谢标志物,这种识别生物标记物的方法可能会用于临床重症指标的监测。Leon等用CE-TOF/MS结合傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)对6个不同品种的玉米进行了代谢组学分析,发现了转基因玉米与野生玉米间特定代谢产物的差异。2.3方法上的合作目前,每种分析平台都存在自身的局限性,诸如定性过程复杂,难实现全部代谢物的定量分析以及准确性不足等许多关键问题仍然有待解决。将多种分析技术的代谢组学数据进行整合,既可提供更全面的代谢物轮廓信息,使结果更完善,也使不同分析技术的结果得到互相验证,达到分析平台优势互补。在这方面,当今许多研究者做出了不同的尝试和探索。Ibanez等采用CE,RP/UPLC与TOF/MS结合等多平台分析技术研究膳食多酚对人类结肠癌细胞的的抗增殖作用,发现多酚类代谢产物呈现显著差异,为代谢组学研究提供重要信息,这些结果可能为将来对此病预防或治疗提供参考依据。Jung等采用NMR和UPLC-MS相结合的分析方法分别测定了2种不同处理方式的黄芪根样本,结果显示去皮根的某些主要代谢物显著损失,表明该技术在对中药材采收后处理中评估分析有效成分提供有力的工具。Naz等采用多平台分析技术对大鼠血清样本进行了代谢组学的研究,找到了相关标志物。应用多个分析技术互补的代谢组学研究思路,还成功地应用于大鼠肺癌样本的分析,取得了显著的成效。3生物代谢研究随着现代分析技术的快速发展以及数据处理软件的不断完善,代谢组学的发展