细胞工程动物要点总结

第十章动物染色体工程动物染色体倍性改造染色体倍性改造工程是指有目的、有计划地增加或减少一组或几组同源或异源染色体，以创造动植物新品种的一项染色体工程技术，主要包括多倍体育种和单倍体育种。染色体加倍技术1、化学诱导方法：（1）秋水仙素：秋水仙素能抑制和破坏纺锤丝的形成。因此，用秋水仙素处理正在分裂的细胞，可使染色体正常复制而细胞不发生分裂，从而形成同源多倍体的细胞。（2）细胞松弛素B：通过抑制动物的肌动蛋白聚合成微丝，阻止细胞质的分裂。（3）麻醉剂N2O等。2、 物理诱导法：（1）温度休克法：包括略低于致死温度的冷休克法（0〜5°C）和略高于致死温度的热休克法（30C左右）两种。温度休克法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段。它受三个因素的制约：温度处理的开始时间，即受精后的时间（TA）处理持续时间（D）处理温度（T）。（2）水静压法:采用较高的水静压（65kg/cm。）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。（3）高盐高碱法.3、 生物学方法生物学方法主要是通过杂交方法，尤其是种间或不同属、科间的远缘杂交，使染色体加倍，也称为染色体组的合并技术。如狮子和老虎杂交，马和驴杂交。多倍体的倍性鉴定1、直接法：（1）染色体计数法：染色体计数是鉴定多倍性的一个准确的直接方法，但比较费时。质量好的染色体标本可以从胚胎获得，因为胚胎细胞分裂指数高。（2）DNA含量测定：流式细胞仪（flowcytomety）可以简单、快速及准确测定单细胞DNA含量，从而确定细胞的倍性。2、间接法：（1）细胞体积测量：按照一般规律，细胞大小与染色体数目成比例增加，而且为维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。红细胞体积测量简便易行。（3）蛋白质电泳（3）生化分析：二倍体和三倍体的血液成分和细胞组成比例不一样。动物多倍体育种的意义：（1）诱导的多倍体动物多数都具有良好的生长率（2）低等动物（如鱼类等）的种间杂交优势也非常明显。人工单性生殖：⑴雌核发育：雌核发育是指精子虽然能正常地进入卵子中并激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，胚胎的发育仅在母体遗传物质的控制下进行。（人工诱导雌核发育是用经物理化学方法处理后失活的精子来“受精”，再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理，以抑制第二极体的排出，使卵子发育为正常的二倍体动物。）（2）雄核发育雄核发育是用物理化学方法处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。相比之下，雄核发育研究比雌核发育要少得多。动物染色体结构的改造：（1）放射线诱导发生染色体缺失突变（放射线可以使染色体产生缺失、易位、倒位、复制及基因内的点突变。）（2）Cre2对loxP位点介导的染色体重组：loxP的位置和方向不同，Cre重组酶介导重组形成的产物亦不相同，可以导致染色体的倒位、删除和易位，实现染色体的定点操作，克服了用放射线诱导产生的突变不能定位的缺点。人工染色体指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。其中包括3个关键序列：自主复制DNA序列（ARS）、着丝粒DNA序列（CEN）、端粒DNA序列（TEL）。种类包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、P1派生人工染色体（PAC）、哺乳动物人工染色体（MAC）和人类游离人工染色体（HAEC）。组织工程：核心是由种子细胞和生物活性材料构成三维空间复合体。基本方法：首先由自体或异体组织分离干细胞，经体外扩增达到一定的细胞数量后，将这些细胞作为种子细胞种植在预先构建好的聚合物骨架上，这种骨架提供了细胞三维生长的支架，在适宜的生长条件下细胞沿聚合物骨架迁移、铺展、生长和分化，最终发育形成具有特定形态及功能的工程组织。第九章转基因动物与动物生物反应器转基因动物:指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。动物生物反应器:动物生物反应器是利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官或组织，进行工业化生产功能蛋白质的技术。（以动物的乳腺为主）制备转基因动物的主要方法有（这个得看书）（1） 基因显微注射法：基本原理是通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。（2） 逆转录病毒感染法：将目的基因重组到逆转录病毒基因组上，人为感染着床前或着床后的胚胎，或直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层细胞共培养而达到转染的目的。（3） 胚胎干细胞介导法：把外源DNA导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表达好的阳性细胞，然后将这些细胞注入受体囊胚腔中，分化成为包括生殖细胞在内的所有组织细胞。（4） 精子载体导入法：直接以精子作为外源DNA载体的转基因方法。（5） YAC介导的基因转移（6） 细胞核移植技术转基因动物的应用：1）改良动物品种（2）用作乳腺生物反应器制备药物（3）建立诊断和治疗人类疾病的动物模型（4）生产可用于人体器官移植的动物器官（5）基因治疗，指将外源功能性目的基因导入患者体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的。如何生产一头乳汁含有绿色荧光蛋白的牛？第七章干细胞与组织工程干细胞的分类：1）胚胎干细胞（2）成体干细胞（3）人工诱导多功能干细胞胚胎干细胞 成体干细胞（1）胚胎干细胞包括ES（胚胎干细胞）细胞和EG（胚胎生殖细胞）细胞。ES细胞:当受精卵分裂发育至囊胚期，胚胎细胞在囊胚腔内成团存在，称为内细胞团。将细胞团的细胞分离出来进行培养，在一定条件下这些细胞可在体外“无限期”地增殖传代，同时还保持其全能性。这种干细胞称为胚胎干细胞即ES细胞。EG细胞是由原始生殖细胞培养分离得到。胚胎干细胞的生物学特性.形态结构和核型（1） 细胞体积小、核大、核质比高，有一个或多个突出的核仁，细胞中多为常染色质，胞质少、结构简单。（2） 体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长。细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清、形态多样，多数呈岛状或巢状。ES细胞具有XX和XY两种核型。xx的没有X染色体失活现象。ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：形成畸胎瘤，将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚层细胞；形成类胚体，将ES细胞在非黏附底物中悬浮培养生长，或控制增殖细胞数目，能够使之生成类胚体，是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体，具有三个胚层组织；直系分化，通过控制ES细胞生长环境或遗传操纵特定基因表达，ES细胞可直接分化成某特定种系细胞；形成嵌合体，将ES细胞注射到同种动物囊胚腔中后，可以形成嵌合体，ES细胞可以参与嵌合体各个器官包括生殖腺的发育，这是检验一个细胞系是否为ES细胞的标准。ES细胞的鉴定（1） 形态学检测细胞形态为圆形或扁圆形，均呈单层或多层密集堆积而形成岛状、巢状群体生长状态。（2） 碱性磷酸酶（AKP）活性的检测碱性磷酸酶在早期胚胎的干细胞中含量较高，而在已分化的细胞中活性明显降低。用固蓝KR或其B盐溶于萘酚AS-TR中，染色未分化干细胞后呈深蓝紫色。（3） 畸胎瘤实验畸胎瘤实验是将ES细胞悬液化注射给同种动物皮下。制作切片染色可观察到畸胎瘤的形成。（4） 体外分化实验将ES细胞悬液培养形成囊状简单胚体或类胚体这类细胞多为自发分化，随培养条件和细胞密度而有所不同。（5） 核型分析法主要是检测已建立的ES细胞是否具有二倍体正常的核型，可用核型分析加以检验。（6） OCT活性检测OCT基因是小鼠胚胎发育早期生殖细胞谱系以及体外培养的多能干细胞特异性表达的一种发育多能性的标志基因。用OCT抗血清和间接免疫荧光法可检测ES和EG细胞中OCT基因的表达产物。制备嵌合体动物利用ES细胞可以获得具有来自两个或多个合子体细胞的个体，即嵌合体，又叫镶嵌体.精原干细胞（EG）指位于曲精细管基膜上既能自我更新维持自身适量恒定，又能定向分化产生精母细胞的一类原始精原细胞。（2）成体干细胞造血干细胞造血干细胞是发现最早、研究最多的一种成体干细胞。它是体内各种血细胞的惟一来源，主要存在于成体的骨髓、外周血、脐带血中。神经干细胞来源：胚胎及成年动物的神经组织中分离。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。（3）人工诱导多功能干细胞（IPS）第四章细胞培养（这章建议和ppt书籍一起学）培养细胞的生物学特征 :（1）体外培养细胞的分型（2）培养细胞的生长特点（3）培养细胞的生长与增殖过程（4）培养细胞的遗传学特征（5）体内外细胞的差异及培养细胞的分化（1）体外培养细胞的分型：.贴壁型细胞贴附是有机体细胞在体内生存和生长发育的基本方式，包括细胞与细胞之间的相互接触和连接和细胞与细胞外基质之间的相互接触两种方式，进行物质和能量的交流。根据体外培养细胞在支持物上贴附生长时的形态，大致分为四种类型。（1）上皮细胞型 细胞呈扁平不规则多角形，中间有胞核，彼此紧密相连，呈单层生长状态。（2） 成纤维细胞型细胞贴壁后呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2〜3个长短不同的突起。起源于中胚层的细胞，如心肌、平滑肌.（3）游走细胞型 细胞质常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，贴附于支持物上散在生长，一般不连接成片。多起源于巨噬细胞。（4） 多形型细胞生长时像神经细胞那样呈多角形，并伸出较长的神经纤维，很难确定它们的形状，起源于神经细胞。.悬浮型细胞某些细胞在体外培养时不需要贴附在支持物上，而是呈悬浮状态生长，如血液中的淋巴细胞、白细胞以及某些肿瘤细胞等。优点：能繁殖大量细胞，容易进行传代培养。缺点：但在观察细胞病变时不如贴壁细胞方便。（2）培养细胞的生长特点1・贴附接触抑制:这种由细胞因接触而抑制细胞运动的现象称为接触抑制。.密度抑制：当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。培养细胞的生长与增殖过程.单个细胞的生长过程细胞周期是指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时期，可分为G1期、S期、G2期和M期等各个阶段。G1期即DNA合成前期。S期即DNA合成期，主要机能活动为进行DNA的合成。G2期为DNA合成后期，又称细胞分裂前期。M期为有丝分裂期，此时每个细胞分裂成两个子细胞。.细胞系的生长过程细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株。细胞系：原代培养物经首次传代成功即称为细胞系。细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。(1)原代培养期原代培养期也称初代培养期，指从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段。原代培养细胞与体内原组织相似性大。传代期原代细胞生长一定时间之后，如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底，这时就需要将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程叫传代。(目前世界上常用细胞系旨在不出10代内冻存)衰退期此期细胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。(在细胞生命期中，少数可发生细胞自发转化。也就是细胞获得永久性增殖能力，成为连续细胞系(株)。连续细胞系的形成主要发生在传代期。转化后的细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性而无恶性。)0责吒拦U 细康4宇阶段 -4———-CEiSMN——I I连续细她系原代培养：是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。所谓细胞“一代”，仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间。每代细胞的生长曲线传代培养：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代或者再培养。体外培养的细胞随着培养时间的延长，细胞数量会不断增加，当增长到一定程度后，由于发生接触性抑制或培养空间及营养物质的消耗，其生长会逐渐减慢，甚至停止及死亡，所以需要传代培养。⑴贴壁细胞的消化法传代贴壁细胞一般用胰蛋白酶和EDTA混合液进行消化。当发现细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，可立即吸除或倒掉消化液，向瓶内注入Hank’s液数毫升，把残余消化液冲掉，然后再加培养液，终止消化。贴壁细胞传代时应注意下述问题：1） 择适当时机进行传代。若细胞没有生长到生长基质的80%表面面积以前，不要急于传代。2） 不同细胞的传代要区别对待。各种细胞对消化反应不同，有的敏感，有的迟钝，因此应根据所用细胞特点制定适宜消化措施。3） 消化液浓度要适宜，过浓时消化作用强烈，细胞反应快，所需消化时间短，掌握不好，细胞易流失。4） 首次传代的细胞接种数量可适当多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。5） 部分贴壁生长细胞不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞（如HeLa细胞等）。（2）悬浮细胞传代因悬浮生长细胞不贴壁，传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。（4）培养细胞的遗传学特征.染色质与染色体改变原代培养细胞多呈二倍体，经传代成细胞系后，细胞可保持二倍体状态。但长期传代的细胞可能发生偏离二倍体现象，即染色体数多于或少于正常数目。.细胞性别间期时女性有一个X染色体呈现明显的固缩状态，紧贴在核膜内面，称Barr小体。男性Y染色体在间期时形成颗粒状Y小体，位于胞核近中央位处。（5）体内外细胞的差异及培养细胞的分化体内细胞通过不断的生长繁殖，不仅数量增加，而且形态与功能会发生分化，最后导致各种组织的形成与器官的发生。当将体外培养的细胞，由于失去了神经、激素等体液的调节和细胞间相互影响，分化逐渐减弱或不显，出现类似返祖现象。表现为：【1】细胞形态与功能趋于单一化；【2】传一定代数后衰老死亡，或发生转化，成为能无限传代的连续细胞系或恶性细胞系。细胞培养液细胞培养液:培养液是模拟细胞在体内生存的生理环境，是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。维持细胞在体外生长的液体。平衡盐溶液：平衡盐溶（BSS）是从Ringer生理盐水发展起来的，是组织细胞培养中常用的基本液体。可以维持渗透压、调节pH以及供给细胞生存所需的能量和无机离子成分，主要作为合成培养基（液）的基础液及用于洗涤组织、细胞等。一般含少量的酚红，易于观察到培养液pH的变化。消化液：进行原代培养时组织的取材，传代培养中贴壁细胞的分离，都要使用消化液。实质为混合酶液。消化酶抑制液:在含血清培养时，血清中的某些成分可中止消化酶对细胞的作用，所以当用消化酶消化后直接加入培养液即可终止消化酶的消化作用。pH调整液常用的有NaHCO3溶液和HEPES溶液。HEPES是一种弱酸，它对细胞无毒性作用，是一种氢离子缓冲剂，主要作用是防止培养基pH迅速变动。谷氨酰胺补充液:谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加。但由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，故需现用现配。一般配制为100倍浓缩液.培养基天然培养基：天然培养基主要指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。优点：含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、pH等也与体内环境相似缺点：成分复杂、来源受限、制作过程复杂、批次间差异大。合成培养基：通过顺序加入准确称量的高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含的成分（包括微量元素在内）以及他们的量都是确切可知的。合成培养基一般用于实验室中进行的营养、代谢、遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究。优点：它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标准化的体外生存环境。合成培养基尚未成为十分完全的培养基。它只能维持细胞不死，不能促进细胞增殖生长。血清：血清可来自多种动物，目前用于细胞培养的血清主要牛血清（胎牛血清、新生牛血清、小牛血清）、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清以及人血清等。血清的成分：血清对维持体外细胞的生长具有极为重要的作用。它能提供细胞生存、生长和增生所必需的激素和生长调节因子等物质。血清也中含有不少有害于细胞生长和繁殖的物质，例如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等。大部分血清在使用之前必须以过灭活处理灭活的目的是去除血清中的补体成分，避免补体对细胞产生细胞毒作用。灭活后的血清可在4°C冰箱内贮存较长时间，长期保存应在-20C以下。（分装，短时用完）血清的使用浓度一般为5%〜20%,最常用的是10%。实际工作中往往将天然培养基与人工合成培养基结合使用。常用培养技术悬滴培养：将培养液滴于盖玻片上并铺展开，将待培养的组织或器官植块放于铺展开的培养液中央部位，然后将盖玻片翻转放于凹载玻片上，密封后进行培养。优点是活体观察时可直接使用油浸物镜，缺点是容易破碎、容易造成污染。培养瓶培养培养瓶培养就是将拟培养对象直接接种在培养瓶内再入培养箱进行培养的方法。旋转管培养*将所培养的组织细胞接种在称为旋转管内，再将旋转管固定在一可旋转的装置上，边旋转进培养的一种培养方法。在培养过程中，组织块或细胞是交替地与培养液和空气直接接触，有利于物质交换和细胞生长。克隆培养法克隆培养法又称作单细胞分离培养法，就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁衍成一个新的细胞群体的培养技术。饲养层细胞：是一层经过射线照射或丝裂霉素C作用后失去分裂能力，供其他细胞附着的细胞层。

第五章细胞融合与单克隆抗体单克隆抗体：由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。细胞融合：又称体细胞杂交或细胞杂交，是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。单克隆抗体技术的原理：B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能进行无限分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代，但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性。HAT选择原理：HAT培养基根据细胞由次黄嘌吟核昔酸(H)和嘧啶核昔酸(T)合成DNA途径而设计的。正常细胞合成DNA有主要途径和补救途径。当主要途径被氨基喋吟阻断时，这两株细胞不能增殖。如将这两株细胞融合，则只有异核体杂交瘤细胞能在HAT培养基上存活，因为两种细胞相互补充了另一种细胞缺失的酶；而未融合的细胞或自身融合的同核体细胞仍然是而TK-或HGPRT-被淘汰。主要途径主要途径是由氨基酸和其他小分子化合物合成核昔酸，进而合成DNA的过程。在主要途径中，叶酸(folicacid)及其衍生物是必不可少的酶。氨基喋吟(aminopterin,A)抑制叶酸。补救途径利用次黄喋吟和胸腺嘧啶脱氧核昔酸。这些细胞内具有次黄喋吟一一鸟喋吟磷酸核糖转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核昔酸激酶(TK)，如缺乏其中一种，补救途径就不能发挥作用。DNA合成途彳圣从头合成逢桥阻断)阻断)和TK随,从头合成逢桥阻断)阻断)和TK随,DNA人源性单克隆抗体制备1、 人-鼠杂交瘤单克隆抗体（方法同下面实验）2、 EB病毒转化技术3、 人-人杂交瘤单克隆抗体4、 EBV转化-融合技术5、 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体如何制备单克隆抗体，实验过程1、骨髓瘤细胞选择（1） 不产生抗体（2） HGPRT-或TK-（筛选HGPRT-细胞比筛选TK-细胞要容易）可用8-杂氮鸟嘌吟或6-巯基嘌吟来筛选HGPRT-突变体。2、动物选择（1）免疫动物的选择。品系与所采用的骨髓瘤细胞差异越远，产生的杂交瘤细胞稳定性越差，在实际单克隆抗体制备过程中一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品系的动物进行免疫。（2）抗原与载体抗原分为可溶性抗原和颗粒性抗原。可溶性抗原：蛋白质、核酸、多肽、多糖等。而可溶性抗原免疫时添加适量的佐剂可提高免疫效果。可溶性抗原可将其固定在载体上而使之成为颗粒性抗原。颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌、细胞等。一般颗粒性抗原都有较强的抗原性，免疫时可不加佐剂(3)免疫途径除抗原性状和动物反应外，适当的免疫途径对免疫效果的好坏同样具有重要意义。不同的抗原可经不同途径进行免疫，较为常用的途径有腹腔、皮下淋巴样器官或静脉等，但其中最为常用的途径是腹腔注射。.亲本细胞的准备脾细胞分离断颈处死小鼠，依次用2.5%碘酊和75%酒精进行皮肤消毒，打开腹腔，小心取出脾脏，注入0.5ml无血清培养基使脾脏轻度肿胀，用小号针头多点刺破脾脏被膜，轻轻挤压使淋巴细胞逸出。小鼠骨髓瘤细胞一些品系的小鼠经腹腔注射矿物油可诱生出骨髓瘤。4、细胞融合细胞融合实际上包含多个过程：首先是两个亲本细胞并列，细胞膜接触，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。融合细胞表面的特征性变化，有膜成分和胞质成分交流以及细胞内电导率的连续性。(1)细胞融合剂和融合手段病毒融合剂可用作融合剂的病毒有10几种，包括DNA病毒中的疱疹病毒、痘病毒、兔痘病毒以及RNA病毒中副黏病毒科的仙台病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、新城鸡瘟病毒、致瘤病毒、日冕病毒等有膜病毒仙台病毒诱导细胞融合1、 先将亲本细胞分别制成悬液、混合离心2、 将沉积细胞悬于1ml灭活的仙台病毒悬液，置冰浴间歇摇动20分钟，细胞凝集3、 温度升至37°C，间歇摇动30分钟，使其进行融合4、 洗去病毒，即可将融合物悬浮于选择性培养基进行培养。化学融合剂3）电融合技术将细胞置于电融合室电介质溶液中，对融合室施加交流电场，细胞在电场力作用下极化产生偶极离子，在电场中沿电力线紧密排列呈串珠状5.融合细胞的筛选与克隆（1） 融合细胞的筛选筛选杂交瘤的方法大致有第二抗体法、抗原结合法和功能筛选法三类。第二抗体法1、 将抗原固定于微量滴定板孔中。2、 再加入含抗体的杂交瘤培养上清。洗去没有和抗原结合的抗体。3、 加二抗。结合于抗原的抗体和被标记的第二抗体特异结合。第二抗体可用荧光素或酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等）或同位素标记。4、 加反应底物。（2） 融合细胞的克隆常用的细胞克隆方法主要包括有限稀释法和软琼脂法两种。1） 有限稀释法。是指从有阳性抗体分泌孔中收集杂交瘤细胞，经逐步稀释使每孔只有一个细胞。因单细胞克隆培养时细胞处于不利于生长的环境，在培养孔可加入饲养层细胞以提高克隆效率。2） 软琼脂法。则是用含20%胎牛血清的完全培养基配制的含0.5%琼脂培养基进行培养。37°C、5%CO2培养箱中培养7d左右在解剖显微镜下观察和采集克隆，然后转移到已加有饲养层细胞的胞的96或24孔板中再进行培养，并检测抗体分泌情况。（3）杂交瘤细胞及其单抗的鉴定1） 染色体鉴定能稳定高产分泌抗体的杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中。2） 特性鉴定3） 类别鉴定4）单克隆抗体纯度鉴定第六早胚胎工程精子的结构精子由头部、颈部、尾部组成。尾部由中段、主段和末段组成。头部由细胞核组成，前端2/3被顶体覆盖颈部很短，起自近端中心粒，止于远端中心粒。尾部轴丝组成，分中段、主段和末段组成。轴丝有9+2型纤维组成。中段是轴丝外面包裹有线粒体鞘，线粒体外面有质膜。主段最长，外面由致密的纤维鞘包围，粗纤维由9条变为7条，进入尾段，7条粗纤维也消失，只有轴丝外面包有质膜。细胞膜_Cellmembranerfv'.sneeith7线粒体鞘细胞膜_Cellmembranerfv'.sneeith7线粒体鞘中央:做线Centralrrycrotubule头HeadI颈Neck体BobyOvum卵细胞城ODlernm?!核Ovum卵细胞城ODlernm?!核Nui^leUi£Oopla&m卵子的结构卵母细胞由细胞质和细胞核组成。细胞膜外有透明带包围，两者之间的间隙为卵周间隙。透明带的周围有卵丘细胞组成的放射冠。细胞质内有卵黄、脂肪滴、线粒体、高尔基复合体、内质网等。此外，还有皮质颗粒，在受精过程中起重要的作用。透明带上有ZP1、ZP2、ZP3蛋白，在功能上ZP3是精子的第一受体，ZP2是精子的第二受体，而ZP1只起连接ZP2、ZP3的作用。fA射也Coronanacliiial^选明带21onapellwcida输卵管的结构包在系膜内，有许多弯曲，长15-30cm，前1/3较粗，称为壶腹部，是受精的地方，其余部分较细，是峡部。输卵管靠近卵巢端扩大呈漏斗状，叫漏斗部，漏斗的边缘形成许多褶皱，称为输卵管伞。受精：精子与卵子融合形成受精卵，这个过程就是受精（fertilization）。受精的基本过程1、精子穿越放射冠当精子和卵子接触时，顶体内的透明质酸酶溶解卵子放射冠里的透明质酸，从而使精子进入放射冠。2、 精子穿越透明带（1） 透明带上有精子结合的受体ZP1、ZP2、ZP3。（2） 顶体反应的诱导精子的头部上的受体和卵子细胞膜上的ZP3结合后，可触发钙离子进入到精子头部，引起顶体以外排的方式释放内容物，引发顶体反应，释放各种酶，如顶体酶，溶解透明带。（3） 精子和透明带的次极结合及精子穿越透明带发生顶体反应后的精子顶体上的ZP3受体丢失，这时，顶体后膜上的ZP2受体和ZP2结合。从而使精子固定在透明带上。当透明带被顶体素溶解后，就穿越透明带到卵周间隙。3、 精子进入卵黄囊精子进入卵周间隙后，发生顶体反应后的精子立即识别并结合卵母细胞膜上的结合位点，这时卵子别精子激活，随后启动精-卵质膜融合系统，实现受精。多精入卵的阻止（1） 大多数哺乳动物的卵母细胞质里多有圆形、外包介膜的细胞器-皮质颗粒，当卵母细胞成熟后，皮质颗粒单层排列在细胞膜下方，一旦精子和卵子融合后，颗粒内的酶释放到卵周间隙，引起透明带糖蛋白的变化，透明带硬化，从而阻止其他精子进入。（2） 卵黄膜的变化卵子受精后，卵黄质膜也发生变化，阻止精子进入。（3） 皮质颗粒膜的形成受精后，皮质颗粒内容物吐放到卵周间隙中，在受精卵质膜的表面形成一层结构，称为皮质颗粒膜。早期胚胎发育阶段划分：卵裂早期胚胎的有丝分裂，是胚胎向子宫角移行的过程中形成的。在透明带里进行.1、 桑椹胚：此时合子在透明带内进行卵裂，呈几何级数增加。卵裂球大约增到16〜32细胞期后，细胞从球形变为楔形，形似桑根状，称为桑根胚。这时期的桑根胚及进一步发育的蠢胚一直呈游离状态，与母体没有建立固定的关系，所以，可以利用这个特点进行胚胎移植工作。2、 囊胚：桑根胚继续发育，细胞开始分化。胚胎的一端，细胞个体较大，密集成团称为内细胞团，将发育为胚体;另一端，细胞个体较小，只延透明带的内壁排列扩展，这一层细胞称为滋养层，将发育为胎膜和胎盘（工分）。在滋养层和内细胞团之间出现靠胚腔，这一发育阶段的胚胎称囊胚。囊胚初期，细胞束缚于透明带内，随后囊胚进一步扩大，逐渐从透明带中伸展出来，这一过程叫做”孵化”。此时细胞特点：滋养层细胞将来发育为胎盘和绒毛膜，内细胞团细胞将来分化为内胚层，中胚层和外胚层，最终形成胎儿。3、 原肠胚：胚泡进一步发育，滋养层细胞退化，内细胞团裸露出来成为胚盘。在胚盘的下方｛行生出内胚层，它沿着滋养层的内壁延伸、扩展，衬附在滋养层的内壁上，这时的胚胎称为原肠胚。在内胚层的发生中，除绵羊是由内细胞团分离出来外，其它家畜均由滋养层发育而来。原肠胚进一步发育，原来的滋养层变成外胚层，在外胚层和内胚层之间出现中胚层；中胚层进一步分化为体壁中胚层和脏壁中胚层，两个中胚层之间的腔隙，构成以后的体腔。三个胚层的建立和形成，为胎膜和胎体各类器官的分化奠定了基础。高等动物的胚胎发育包括受精、卵裂、囊胚、原肠胚、中胚层及体腔形成、胚层分化等主要阶段。精子的获能：精子必须在生殖道中停留一段时间后才具备受精能力，这一现象称为精子的获能。胚胎基因的激活：哺乳动物发育到一定阶段，胚胎基因组才开始转录，在胚胎发育的早期阶段是靠卵母细胞内的蛋白质、RNA或其它物质。妊娠识别：.在妊娠初期，孕体发出信号(类固醇激素或蛋白质)传递给母体作用于母体，母体随即产生反应，以识别孕体的存在。卵泡的划分：原始卵泡：由一个初级卵母细胞和一层扁平的卵泡细胞构成，位于卵巢皮质的浅层.初级卵泡:初级卵母细胞已经增大，由单层或多层卵泡细胞构成。次级卵泡:卵泡细胞数量和层数增加，卵泡体积增大，在卵泡细胞间出现卵泡腔。成熟卵泡排卵：随着卵泡的增大，卵泡逐渐向卵巢表面突出，在胶原酶和透明质酸酶的作用下，卵泡破裂，卵细胞、透明带和放射冠等随卵泡液一起由卵巢排出，经腹膜腔进入输卵管.(卵子在输卵管里的运行主要靠管壁纤毛摆动和蠕动和液体流动)卵子的激活：哺乳动物和海星受精时，卵内自由钙离子突然释放，产生钙离子波。钙离子波首先在精子入卵处形成，然后以每秒5〜10〃m的速度向整个