生化综合性试验

PAGEPAGE6实验四十五胃蛋白酶在水溶液和有机溶剂中的动力学测定一．目的和要求1学习并掌握胃蛋白酶活性测定的基本原理。2掌握在水相和有机相中胃蛋白酶Km、Vmax测定的实验设计和测定原理。3学习和理解酶促反应动力学曲线的实验设计和实验方法。4熟练掌握紫外分光光度计的使用方法。二．实验原理近几年，酶在有机介质中催化反应的研究十分活跃，日益增多的研究报导和综合评述展示了有机溶剂中的酶优于水相酶的巨大应用潜力。而酶在有机介质中催化活性的充分发挥和催化选择性的调节与控制是有机溶剂中酶催化研究的重要基础与核心。有机溶剂中的酶催化已经进行了四种体系的研究：a.单相共溶剂体系(水/水溶性溶剂；b.水-有机溶剂两相体系；c.微水有机溶剂体系；d.反向胶束体系（reversedmicelles）。有机相中酶促反应的过程、机制与水溶液中是相同的，符合米氏方程、乒乓反应机制。米氏酶在非水介质中的反应符合Michaelis-Menten公式，影响有机介质中酶促反应动力学变化的因素涉及底物和溶剂的性质。酶和溶剂竞争底物，如果底物与溶剂的亲和性高，则底物与酶的亲和力低，Km大；如果底物与溶剂的亲和力低，则酶与底物的亲和力高，Km小。胃蛋白酶（Pepsin）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物，它也具有脂酶活力。其分子量约为23000~35000。酪蛋白是一种蛋白质，它被蛋白酶降解生成的酪氨酸，在紫外光区275nm处有吸收峰，根据测定275nm处的吸收值，可以判定蛋白酶的活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说胃蛋白酶分解的酪蛋白多，酶活力高。在保持恒定的合适条件（时间、温度及pH、激活剂）下以同一浓度的胃蛋白酶催化不同浓度的底物酪蛋白分解，于一定限度内，酶促反应速度与酪蛋白浓度成正比。因此，用酶促反应速度倒数（l/V）为纵坐标，酪蛋白浓度倒数（l/[S]）为横坐标，用双倒数作图法可以计算得到胃蛋白酶在水相和有机相中的Km、Vmax。胃蛋白酶活性（反应速度v）定义：蛋白酶催化酪蛋白水解，每分钟使生成的酪氨酸的A275nm上升0.01为1个酶活力单位（U）。胃蛋白酶比活力定义：每毫克（mg）蛋白中具有的催化活力，U/mg。该胃蛋白酶的纯度达到电泳纯（PAGE1条电泳带），所以可以直接使用实验所称的毫克数为胃蛋白酶的蛋白含量（mg）。三．实验仪器和用品1实验仪器：（1）紫外分光光度计（石英比色杯）（3~4台），（2）水浴锅（2~3台），（3）电子天平（2台），（4）台式天平（离心平衡用）（2台），（5）冰箱（1台）。2实验用品：（1）以组为单位带塞试管（30支），试管架（2个），100mL烧杯（2个），200mL烧杯（1个），吸管（2支）、玻棒（1支），移液管或移液枪5mL（1支）、1mL（2支）、0.5mL（1支）、0.2mL（1支），漏斗（3个），滤纸（1盒），100mL量筒（1个），蒸馏水瓶（1个），标签纸。（2）全班共用1000mL试剂瓶（7个），250mL试剂瓶（3个），1000mL烧杯（4个），2000mL塑料烧杯（2个），1000mL量筒（2个），500mL量筒（2个），容量瓶250mL（1个）、100mL（1个），pH广泛试纸（1~2？？），剪刀（2个），电炉和锅（2-3个），蒸馏水容器（50L）（1四．实验材料和试剂配制1实验材料：市售胃蛋白酶2试剂配制：（1）全班共用试剂：①1mol/LHCl溶液1000mL：取浓盐酸84mL，用量筒定容至1000mL，配制成1mol/L的盐酸溶液。②1mol/LNaOH溶液100mL：取4gNaOH（2）6个小组为一个大组，共用以下试剂：③0.065mol/L的HCl溶液：取1mol/L的盐酸溶液65mL，加蒸馏水用量筒定容至1000mL，配制成0.065mol/L的盐酸溶液。④2.4%（W/V）酪蛋白：配500mL。称2.4g酪蛋白，加入80mL蒸馏水，55℃水浴加热，边搅拌边加入1.6mL1mol/L的NaOH助溶，待酪蛋白完全溶解后，迅速加入4.8mL1mol/LHCl使pH值至1.5，边快速加入HCl边搅拌，使酪蛋白溶解，然后用容量瓶加蒸馏水定容至100mL。1）1.2%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL2.4%酪蛋白，用0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容到100mL。2）0.6%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL1.2%酪蛋白，用0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容到100mL。3）0.3%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL0.6%酪蛋白，用0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容到100mL。4）0.15%（W/V）酪蛋白：配100mL。取50mL0.3%酪蛋白，用0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容到100mL。⑤20%（W/V）三氯乙酸（TCA）：配500mL。称20gTCA溶解于蒸馏水，并用量筒定容至100mL。⑥48%（V/V）丙三醇溶液：配100mL。量取48mL无水丙三醇，加0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容至100mL。⑦配不同浓度二甲基亚砜（DMOS）：1）24%（V/V）DMOS：配200mL。量取24mLDMOS，用0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容至100mL。2）48%（V/V）DMOS：配100mL。量取48mLDMOS，用0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容至100mL。3）72%（V/V）DMOS：配100mL。量取72mLDMOS，用0.065mol/L的盐酸溶液于量筒定容至100mL。五．实验步骤12mg/mL胃蛋白酶制备（300mL/6个小组）精确称取200mg胃蛋白酶粉，用0.065mol/L盐酸溶液溶解并于容量瓶定容至100mL，即得2mg/mL的胃蛋白酶液。2不同浓度DMSO（二甲基亚砜）对胃蛋白酶的活性影响按表1加试剂和操作，各种浓度的有机溶剂分别以相对应的CK管做空白调零。表1不同浓度DMSO对胃蛋白酶的活性影响有机溶剂终浓度（％）0102030试管号CK11CK22CK33CK442.4%酪蛋白(mL)02020202不同浓度DMSO(mL)002(24%)2(24%)2(48%)2(48%)2(72%)2(72%)0.065mol/LHCl(mL)2200000020%TCA(mL)222237℃恒温水浴，准确保温102mg/mL胃蛋白酶液(mL)0.80.80.80.80.80.80.80.837℃恒温水浴，准确反应1020%TCA(mL)020202022.4%酪蛋白(mL)20202020反应总体积（mL）6.86.86.86.86.86.86.86.8过滤A275nm酶活性（U）U=100×A275nm/t3在水相中胃蛋白酶水解酪蛋白的Km和Vmax（采用双倒数作图法）按表2加试剂和操作，在水相中，测定不同的底物（酪蛋白）浓度与反应速度（v）的变化。本组实验各底物浓度均以1号管调零，t为分钟。用酶促反应速度倒数（l/V）为纵坐标，酪蛋白浓度倒数（l/[S]）为横坐标，用双倒数作图法得胃蛋白酶在水相中的Km、Vmax值。表2在水相中不同浓度的胃蛋白酶水解酪蛋白的反应速度测定组数123456底物终浓度（mg/mL）00.6251.252.55.0100.065mol/LHCl(mL)222222不同浓度酪蛋白(mL)02(0.15%)2(0.3%)2(0.6%)2(1.2%)2(2.4%)20%TCA(mL)20000037℃恒温水浴，准确保温102mg/mL胃蛋白酶液（mL）0.80.80.80.80.80.837℃恒温水浴，准确反应1020%TCA（mL）0222222.4%酪蛋白(mL)200000过滤总体积（mL）6.86.86.86.86.86.8A275nm[s]（mg/mL）1/[s]V=A275nm/t1/VKm(mg/mL)Vmax4在10%DMSO有机相中胃蛋白酶水解酪蛋白的Km和Vmax（采用双倒数作图法）按表3加试剂和操作：在有机相DMSO中，测定不同的底物（酪蛋白）浓度与反应速度（v）的变化。本组实验各底物浓度均以1号管调零，t为分钟。用酶促反应速度倒数（l/V)为纵坐标，酪蛋白浓度倒数（l/[S])为横坐标，用双倒数作图法得胃蛋白酶在水相中的Km、Vmax值。表3在10%DMSO有机相中不同胃蛋白酶水解酪蛋白的反应速度测定组数123456底物终浓度(mg/mL)00.06250.1250.250.501.0不同浓度酪蛋白(mL)02(0.15%)2(0.3%)2(0.6%)2(1.2%)2(2.4%)24%的DMSO(mL)22222220%TCA(mL)20000037℃恒温水浴，准确保温10胃蛋白酶液（mL）0.80.80.80.80.80.837℃恒温水浴，准确反应1020%TCA（mL）0222222.4%酪蛋白(mL)200000过滤总体积（mL）6.86.86.86.86.86.8A275nm[s]（mg/mL）1/[s]V=A275nm/t1/VKm(mg/mL)Vmax5在20%丙三醇中胃蛋白酶水解酪蛋白的Km和Vmax（采用双倒数作图法）按表4加试剂和操作：在20%丙三醇有机相中，测定不同的底物（酪蛋白）浓度与反应速度（v）的变化。本组实验各底物浓度均以1号管调零，t为分钟。用酶促反应速度倒数（l/V)为纵坐标，酪蛋白浓度倒数（l/[S]）为横坐标，用双倒数作图法得胃蛋白酶在20%丙三醇中的Km、Vmax值。表4在20%丙三醇有机相中不同胃蛋白酶水解酪蛋白的反应速度测定管号123456底物终浓度(mg/mL)00.06250.1250.250.501.048%丙三醇(mL)222222不同浓度酪蛋白(mL)02(0.15%)2(0.3%)2(0.6%)2(1.2%)2(2.4%)20%TCA(mL)20000037℃恒温水浴，准确保温10胃蛋白酶液（2mg/mL）（mL）0.80.80.80.80.80.837℃恒温水浴，准确反应1020%TCA（mL）0222222.4%酪蛋白(mL)200000过滤总体积（mL）6.86.86.86.86.86.8[s]（mg/mL）A275nm1/[s]V=A275nm/t1/VKm(mg/ml)Vmax六．结果与计算1根据双倒数作图法，可求出胃蛋白酶在水相中的Km和Vmax。2根据双倒数作图法，可求出胃蛋白酶在有机相DMSO中的Km和Vmax。3根据双倒数作图法，可求出胃蛋白酶在有机相丙三醇中的Km和Vmax。4根据双倒数作图法，可求出水相及有机溶剂中胃蛋白酶的动力学参数Vmax、Km，分别填于表5中，试分析它们之间的差异。表5水相及有机溶剂中胃蛋白酶的动力学参数反应体系Vmax（U）Km（mg/mL）水相10%DMSO20%丙三醇七．注意事项1配制酪蛋白溶液时，一定要按要求操作，加盐酸一定要快速，边快速加入HCl边搅拌，才能使酪蛋白溶解，否则，会使溶解的酪蛋白出现沉淀。2要确保酶促反应的时间，根据酶活动定义计算酶的活力。