细菌纤维素的生物合成与应用

细菌纤维素的生物合成与应用

0细菌纤维素bacterity,bc椰子是基于-1和4-糖苷键的亲水葡萄糖，其化合物为（c6h10o5）n。它是自然界合成最多的生物因素。纤维素广泛分布于高等植物中,少量在藻类、真菌、细菌、单细胞生物(原生动物,如阿米巴虫)、无脊椎动物、哺乳动物(被囊动物)中。目前人类使用的纤维素主要来源于植物,但植物纤维素与木质素、半纤维素紧密结合,形成一种复杂的高分子聚合物,很难用生物和机械的方法分离。因此,要获得高纯度纤维素需要经过复杂的化学处理,不但大量消耗能量、污染环境,也会导致纤维素在结构上发生不可逆的变化,丧失了纤维素某些优良的特性。某些真菌、藻类的细胞壁也含有大量纤维素,但是其中也包含很多杂质,如木聚糖、甘露聚糖和半纤维素等。细菌纤维素(BacterialCellulose,BC),即由细菌产生的纤维素,又称微生物纤维素(MicrobialCellulose)。很多细菌如醋酸杆菌、农杆菌、无色杆菌、产气杆菌、固氮菌、假单胞菌、沙门氏菌、大肠杆菌和根瘤菌都能产生纯度很高的胞外纤维素。其中木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus)是发现最早、研究最为透彻的纤维素产生菌株,也是研究纤维素生物合成过程和机制的模式菌株。BC具有高纯度(99%)、高聚合度(2000~8000)、高结晶度(60%~90%)的特点;持水性好,可保持重于自身几百倍的水;具有高弹性模量和拉伸强度,很适于作为纸张和特殊产品的强度增强剂;还有较高的生物适应性和良好的生物可降解性,可用作伤口敷料和组织工程支架;BC生物合成时,性能具有可调控性。1提高bc生产效率的措施随着对BC物理特性认识的深入,人们不仅可以通过培养条件的改善,提高BC的生产效率,还可以通过改变其形态、聚合程度、分子量等,满足对BC应用的需求。此外,人们还对BC的合成机制等方面开展了大量的工作。1.1不同碳源、培养条件对bc产量的影响BC可采用静置培养和摇床培养两种方式进行培养。马霞等人确定了一株BC高产量菌株M12的最适静态培养(图1)条件。当接种量为6%,种龄36h,发酵周期6d,温度30℃,初始pH4.0~6.0,通气量为0.11m3/(m2·h),BC产量达到3.11g/L。通过分批补料发酵和分批发酵实验证明,分批补料发酵的BC产量是分批发酵的3~4倍。Ruka等人优化了木葡糖酸醋杆菌生产BC的静置培养条件,表明在选择的多种培养基中,当分别以葡萄糖,甘露醇和蔗糖为唯一碳源时,纤维素产量相对其它碳源都高。另外,随着静置培养表面积和培养基体积的增加,BC产量也可以提高。由于BC的生物合成需要氧的有效供给,当氧分压为大气压的10%~15%时,BC的产量达到最大值,但随着氧分压的进一步提高,细胞呼吸作用增强,加速TCA循环,使得产生的BC相对减少。1.2生物培养中的bc形态振荡培养时液体培养基在瓶中振荡形成湍流和涡流,随转速增加,气液接触界面积增加,剪切力也随之增加。在湍流、涡流和剪切力的作用下,细胞分泌的微纤维不再沿细胞的长轴方向延伸,而是随培养基的流动而摆动。因此,产生的BC形态会随转速的改变而各异:絮状、雪花状、球形、块状等。随着转速的提高,BC的产量会随之有所下降,BC的结晶度和Iα结构比例也会随之有所下降。马霞等人采用气升式发酵罐培养BC。低通气量时,BC的产量随通气量的加大而提高,当通气量为2vvm时,BC的产量最高为2.40g/L,随着通气量的进一步提高,BC的产量反而下降。培养得到的BC,与界面培养形成BC膜不同,是完全分散在发酵液中,呈不规则的丝状、星状或微团状,表面光滑,用刀将其剖开后,可以发现内部有许多小颗粒状的BC。而将此培养方式与静置界面培养相比,BC产量明显较后者低。1.3木葡糖酸醋杆菌的生长和运动YANLin等人将木葡糖酸醋杆菌置于电场中合成BC,在平行电场方向的纤维束较静置培养的更加粗,且呈现了一定的方向性。木葡糖酸醋杆菌本身带负电荷,在电场作用下,发生定向运动,当外加电场作用使菌体运动的速度大于BC束合成速率时,纤维束拖曳在菌体之后,形成了一定的方向性,相互平行的纤维束互相凝结,即得到了更加粗的纤维束。这为BC在纺织方面的应用展现了新的视角。1.4生存位置的竞争优势微生物的趋向性包括趋化性、趋氧性、趋光性、趋磁性、趋电性、趋温性等,表现为微生物的一种定向移动,是一种微生物适应外界环境变化而生存的基本属性,使其具有寻找食源和逃避毒性环境的能力,因而在生存上具有竞争优势。李晶等人利用游动平板法测定不同碳源对木葡糖酸醋杆菌趋化性的影响为葡萄糖>甘油>蔗糖>麦芽糖,又利用毛细管法研究菌体对不同氨基酸和重金属离子等的趋化性。实验确定了最佳的实验条件为:初始菌浓3×107cfu/mL,温度25~30℃,pH5,最佳趋化时间为60min。1.5微生物引发的抗菌活性肠衣BC的三维网状结构,使得材料形成了一定的孔隙率,在培养过程中加入特定材料,使其填充于空隙中,形成的复合纳米材料,赋予了BC新的性能。朱会霞等利用氧渗透性的硅胶管为载体,利用木葡糖酸醋杆菌直接生物合成出不同直径的BC管。将BC管和ε-聚赖氨酸复合制得的BC管具有抑菌性能、良好的拉伸性能、良好的氧气阻隔性、高透明度和高温耐受性,作为抗菌活性肠衣,抑菌效果极好。利用不同形状的模具、以微生物直接发酵合成了拉伸性能、形状和厚度等产品性能指标可控的BC异型产品。ZHUHui-xia等人将Fe3O4加入到木醋杆菌的培养基中,摇床震荡培养,得到一种磁性BC球。对BSA的吸附试验表明,在BSA小于1.50mg/mL的浓度范围内,磁性球对其吸附率在91.72%以上,经三次吸附实验证明BC球将BSA洗脱后可重复使用;在Pb2+低于100mg/L的浓度范围内,吸附率在84.20%以上,但BC球用于大量吸附试验会发生不可逆形变,限制了BC球作为吸附剂的大量应用。1.6不同碳源对木葡糖酸醋杆菌产碳的效果木葡糖酸醋杆菌的代谢网络由李飞等人构建,木葡糖酸醋杆菌中的磷酸果糖激酶缺失或活力很低,所以在无氧条件下无法代谢葡萄糖。磷酸果糖激酶是糖酵解途径中关键酶之一,因此,木葡糖酸醋杆菌没有从6-磷酸果糖(F6P)到三磷酸甘油醛(GAP)的途径,没有完整的糖酵解途径。本实验室ZHONGCheng等人利用木葡糖酸醋杆菌代谢网络,研究不同碳源下细胞内的碳代谢流,结果表明葡萄糖、果糖、甘油三种碳源,有利于木葡糖醋醋杆菌培养高产量BC,通过代谢流计算得到以葡萄糖、果糖、甘油为碳源合成细菌纤维素的过程中,分别有19.05%的葡萄糖,24.78%的果糖和47.96%的甘油合成BC,而且在以葡萄糖为碳源时,碳源利用率高,可达97.48%,但其中40.03%的C流向副代谢产物葡萄糖酸。甘油的利用率虽然只有48.89%,但是纤维素产量为6.05g/L,远大于葡萄糖的5.01g/L,经计算可得不同碳源下细胞单位碳原子的产量,甘油的生产效率为14.76g/mol,而葡萄糖仅6.19g/mol。因而甘油是高效生产BC的极佳原料。2bc的应用2.1清除脏器中含有有机物的物质由于BC具有优良的持水性、乳化性和凝胶特性,在食品的增稠剂、分散剂和结合剂等领域有广泛应用。作为一种膳食纤维,BC对人体也具有许多独特的功能,如增强消化功能,预防便秘,还有清除食物中有毒物质的作用,所以目前对其在食品中的应用性研究也越来越多。在传统发酵工艺中,富含BC的发酵食品如纳塔和红茶菌,在中国、日本、菲律宾和和印度尼西亚等地深受消费者欢迎。纳塔持水性好,呈半透明凝胶状,广泛应用于果冻、饮料、糖果、罐头等。这些产品富含纤维素,具有减肥、防止便秘的作用。而红茶菌则能促进肠胃消化,增强吸收能力和降低血脂。作为一种食品基料,BC可以作为增稠剂,固体食品的成型剂、分散剂和结合剂等。将其添加至酸奶或者冰淇淋中能够改善口感,增加食品的保健作用。2.2在扩音器材料上的应用造纸原料问题是全世界造纸行业面临的共同难题。通过在纸料中添加功能性材料,克服天然纤维的不足,以生产高质量的纸张或满足特殊领域的需求是造纸专家共同努力的方向之一。BC作为一种新型的生物化学材料具有诱人的商业潜力,早在20世纪80年代,日本味之素和索尼公司联合发表合作研究结果,其研究所得片状的BC成型物可用于扩音器材料,其在极宽的频率范围内传递速度高达5000m/s,复制出的音色清晰、洪亮、远强于普通高级铝制或木质震动膜。在造纸工业中,BC已表现出广阔的应用前景,如在涂料、增稠剂、增强剂、胶黏剂、高强度纸张、防伪纸制品、高品质薄层印刷纸、可循环使用的婴儿尿布等方面的商业开发。BC纤维的直径在0.01~0.1μm之间,对纸张结构的影响类似于一种细小纤维组分的作用,它对纸页的结构会产生三种影响:搭桥、阻塞、填充。当存在细小纤维组分时,相邻两根纤维之间通过细小纤维组分形成氢键连接,细小纤维组分起到搭桥的作用。徐千等人研究发现,当BC的用量为3%时,与植物纤维混合抄纸的耐折度提高了44.7%,耐破指数提高17.9%,抗张指数提高22.4%,撕裂指数提高16.1%。2.3在生物免疫中的应用Williams定义生物材料(Biomaterials)为:采取设定的形式,可以作为一个复杂系统的整体或者部分使用,用来直接控制生命系统成份之间的相互作用,在任何治疗或者诊断的程序当中,可用于人和兽等医学领域的一类物质。近年来,有大量的研究致力于将BC加工为理想的生物医疗器械和材料,如人工皮肤,人工血管,人工角膜,心脏瓣膜,人工尿道,人工骨,人工软骨,人工膝关节半月板以及药物载体、激素载体和蛋白质载体等。BC具有一些独特的性质,如生物活性、生物可降解性、生物适应性和无过敏反应,尤其是良好的机械韧性,有可能作为新型的生物医学材料。Klemm等人曾将BC作为显微外科中的人造血管,发现其具有临床应用价值。马霞等将BC用于大鼠皮肤烫伤修复实验,结果表明,治疗组较对照组的大鼠皮肤愈合率提高,说明BC在一定程度上具有促进伤口愈合的作用。WANGYu-lin等人将BC合成纤维细胞(Fibroblast,FB)一起植入到裸鼠体内进行培养和观察。结果表明BC-FB共同培养物可以很好融入裸鼠的皮肤中。Helenius等人将BC植入到大鼠皮下,评估植入物的有关慢性炎症,异物反应和细胞长入情况。并通过组织学,免疫组织化学和电子显微镜等方式观察血管生成。结果表明,在BC种植体的周围没有出现肉眼可见的炎症迹象,且受体组织内并没有引起任何慢性炎症反应。荧光染色实验证明,BC膜上间充质干细胞存活率为95%。2.4纳米复合材料材料郑祺等人将BC与具有良好生物活性、骨传导作用和骨结合能力的纳米羟基磷灰石复合制成纤维状复合支架材料,不仅具有足够的强度,还具有骨传导功能,以满足骨细胞在支架上的粘附和繁殖,是一种很有前途的骨组织工程纳米支架材料。王玉林等人对此复合材料进行成分组成、热稳定性和热力学行为评价。实验结果表明,纳米复合材料的成分与天然骨相似,并且热稳定性与纯BC相比有所提高。Svensson等人利用牛软骨细胞对天然BC材料进行了评价,结果表明,天然BC材料在保持良好的机械性能的前提下,II型胶原基质可达到正常软骨表达的50%左右,并且支持软骨细胞的增殖。与细胞培养用的培养皿材料和藻酸钙相比,天然BC中培养的软骨表现出明显的高水平生长,且不会导致显著性的致炎细胞因子活化。因此,BC具有作为软骨组织工程支架材料的可能。2.5bc与bc复合膜的生物活性BC还可应用于人工血管和人工角膜。小口径的组织工程血管的移植为微脉管手术灯治疗血管疾病提供了有效的途径。早在2001年,Klemm等人就报道了一种利用Acetobacterxylinum原位成形制备的BC应用于显微外科手术的人工血管。这种称为BASYC(BacterialSynthesizedCellulose)的人造血管具有极强的亲水性,光滑的内表面,在湿态下足够的机械强度,以及良好的生物活性等特性,在显微外科中作为人工血管有着巨大的应用前景。Backdahl等人研究显示平滑肌细胞可以在BC膜上黏附、增殖,并向内部生长。平滑肌细胞在体外培养2周后可向内生长约40μm。同时,他们利用SEM观察了静态培养的BC膜生长形态学,并比较了BC、猪动脉和膨体聚四氟乙烯支架在机械性能上的差异,发现BC与动脉相似。贾卉等人采用BC生物膜为支架分别种植兔和人角膜基质细胞混合培养构建角膜基质膜,并初步取得成功,BC网架纤维结构显示三维多孔状,符合角膜基质三维构建的条件,角膜基质细胞在BC中生长良好,并呈规律的极性排列,与正常角膜基质相似,细胞生物学未发生改变,表明BC具有角膜细胞生长的条件。进行同种异体移植后活体观察复合生物膜逐渐降解,未出现毒性反应,也未影响正常细胞形态和结构。角膜组织切片进一步表明BC是非常有价值的生物支架材料。实验中BC膜并无免疫性,异体角膜细胞作为抗原可以刺激新生血管形成,可见生长在BC膜上的角膜细胞移植后仍然具有生物活性。角膜基质细胞与BC复合膜移植后随着时间的延长无收缩,大小厚度无改变,透明性略差。复合膜随移植后的浓度变淡,表明BC膜有降解性。角膜组织病理学显示:角膜基质细胞-BC复合膜的纤维结构接近正常角膜,膜上可见与正常角膜基质细胞有相同的细胞结构,进一步证实接种到BC生物膜上的基质细胞继续生长,复合膜与正常角膜接触处炎细胞浸润较多,与正常角膜基质粘连较松,可能与移植的复合膜厚度和BC膜本身的物理性质有关,尤其术后未用任何药物治疗,存在手术创面的炎性反应。在BC复合膜中未见空泡形成,表明没有发生急剧降解,作为支架可以稳步地构建基质。但随着移植后时间的推移,BC复合膜是否影响角膜基质细胞性状的改变尚待进一步深入研究。2.6生物复合材料将BC与不同的材料进行复配,以达到改性的效果,已经成为当今世界研究的热点。细菌纤维素作为一种新型纳米材料,具有致密的三维网状结构,其孔隙率因处理手段的不同而不同,约为60~90%。这些空隙使得BC可以和其他材料进行复合,形成的新材料,往往可以赋予BC新的性能。ZHANGXiu-ju等人将硝酸银与BC进行复合,发现其对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有很好的抑菌作用