中药当归对黑色素瘤高转移细胞b16-bl6增殖的影响

中药当归对黑色素瘤高转移细胞b16-bl6增殖的影响

转移和转移是肿瘤最显著的生物学特征，也是癌症临床死亡的主要原因。因此阻止肿瘤细胞的侵袭和转移是恶性肿瘤治疗成败的关键因素。当归是伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diel的干燥根,为临床常用传统中药,有补血活血、润肠调经之功效。当归常用于血液流变、微循环、心血管系统、免疫系统等方面的研究。对肿瘤作用方面的研究,常见的是当归补血饮或者当归多糖的抗肿瘤作用,单味当归影响肿瘤生长、侵袭和转移能力方面的报道相对较少。小鼠黑色素瘤细胞B16-BL6具有高转移特性,是研究肿瘤侵袭转移的理想模型。因此研究单味当归对B16-BL6的细胞的生长、侵袭、粘附、运动和转移能力的影响,将有助于其临床的进一步应用。1实验材料1.1dmem液和新生牛血清fcs中药的制备:将当归生药饮片加10倍量水浸泡1h后文火煎煮2h,滤出上清后再加8倍量水煎煮1h,合并两次上清液,静置,3000r/min离心15min。上清在水浴上浓缩为1g/ml的贮存液,置4℃保存。实验前,用DMEM培养液(不含血清)稀释成所需浓度,过滤灭菌,用于体外实验;或者用蒸馏水直接稀释为所需浓度进行体内实验。DMEM液为Gibco公司产品;新生牛血清(FCS)为杭州四季青产品;牛血清白蛋白(BSA)、噻唑蓝(MTT)为AMESCO公司产品;纤维粘连蛋白(FN)、Matrigel由北京大学医学部细胞研究室提供;层粘连蛋白(LN)为Sigma公司产品;优凯特胶(Eukitt)为Fluka公司产品;Transwell小室为Costar公司产品;无吡咯烷酮的聚酸酯膜PVPF(孔径8.0μm、直径13mm)为Whatman公司产品。1.2实验仪器和仪器190型酶标仪,美国AD公司;NAPCO5410型CO2培养箱,PRECISIONSCIENTIFIC公司;XSZ-DZ型倒置显微镜,重庆光学仪器厂;SW-CJ-10超净工作台,苏州市洁净技术研究所。1.3范大学分子与医学实验室李朝军教授赠小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6由南京师范大学分子与医学实验室李朝军教授赠送,自行传代保存。B16-BL6细胞在37℃和5%CO2条件下,培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液中。1.4实验动物C57BL/6小鼠,雄性,6～8周龄,体重(20±2)g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供(SCXK<沪>2003-0003)。2方法2.1药物对细胞生长的抑制率测定采用carmichael的MTT法,略作修改。取对数生长期的细胞,0.25%胰蛋白酶消化,离心收集细胞,用培养基稀释成5×104/ml,加入96孔板中,每孔100ml,每个样品点6个复孔。培养24h后,换液,每孔加入含药培养液100μl(当归终浓度为16.67、13.33、10.00、6.67、3.33mg/ml,临用时用培养液将贮存液稀释配置),对照孔直接加入100μl培养液。37℃培养48h后,每孔加入20μlMTT(2mg/ml),再培养4h,弃上清液,各孔加入100μlDMSO溶解结晶,于酶标仪(SPECTRAMAX190)上测量波长570nm处OD值,实验重复2次。按下式计算药物对细胞生长的抑制率(IR)。IR(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%2.2药物对细胞黏着性的抑制率测定将LN2μg铺于96孔板,室温过夜干燥后,用2%BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液20μl37℃封闭1h后,PBS洗3次,每孔加入8×104个预先经药物作用48h的B16-BL6细胞,37℃和5%CO2培养箱中培养1.5h后,PBS轻轻吹打2次,洗去未粘附的细胞,弃去残余PBS,每孔加入20μlMTT(2mg/ml),于细胞培养箱中继续培养4h,弃上清,每孔加入100μlDMSO溶液,振荡混匀后,于酶标仪上测定570nm处OD值,实验重复2次。按下式计算药物对细胞粘附的抑制率(IR)。IR(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%2.3mdem的体外渗透活性测定将PVPF滤膜贴于Transwell小室中,滤膜的外表面涂FN5μg,内表面涂Matrigel10μg,室温过夜干燥,形成一个基质屏障层。用0.25%胰蛋白酶消化预先经药物处理24h的B16-BL6细胞,以2×106/ml密度重新悬浮于含0.1%BSA的DMEM无血清培养基中,取100μl上述细胞悬液加入Transwell小室中。将小室置于24孔板中加入600μl含0.1%BSA的DMEM无血清培养基,37℃孵育4h,将滤膜在甲醇中固定1min,苏木精及伊红染色,擦去Matrigel一侧未穿过膜的细胞,用Eukitt胶将滤膜封于载玻片上,400倍光学显著镜下选择滤膜上下左右中5个不同视野,计数每个视野侵袭细胞数,计算平均值,实验重复2次。按下式计算药物对细胞侵袭的抑制率(IR)。IR(%)=(1-实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)×100%2.4药物对细胞运动能力的抑制率除了在PVPF膜内表面不铺Matrigel,其余步骤与侵袭实验相同。按下式计算药物对细胞运动能力的抑制率(IR)。IR(%)=(1-实验组平均运动细胞数/对照组平均运动细胞数)×100%2.5动物肺转移灶单次给药及解剖组织观察取对数生长期的B16-BL6细胞,0.25%胰蛋白酶消化后,离心收集2次,重悬于PBS中,调整细胞浓度为1×107/ml。每只小鼠右肢爪垫皮下注射瘤液50μl。次日将动物随机分组,以等体积(0.4ml)不同浓度口服灌胃给药,对照组给予等体积生理盐水溶液,连续给药35天,一天一次。接种瘤液后约3周(对照组瘤体≥10mm3)时,在0.6%戊巴比妥钠麻醉下高位截除小鼠荷瘤侧后肢。对截下的原发灶后肢称重,并按照下列公式计算抑瘤率。继续给药约2周,处死动物,称体重。解剖取肺、脾、胸腺,称重并用10%甲醛溶液固定组织。在解剖显微镜下计数肺组织表面肿瘤结节数,比较各组动物肺转移灶数目及大小。抑瘤率(%)=(1-实验组平均原发灶后肢重/对照组平均原发灶后肢重)×100%脾指数(%)=(脾重/体重)×100%2.6统计学分析应用SPSS11.0统计软件对肺转移灶数目采用Mann-WhitneyU检验法进行统计学分析,其余计算资料采用Independent-samplesTTest检验,计数资料采用Chi-square检验(即χ2检验)。3结果3.1生长抑制率的影响当归水提液随着浓度的递减对B16-BL6细胞的增殖生长的抑制率逐渐降低,甚至有促进增殖的作用。浓度为16.67mg/ml时,OD570nm有显著意义,抑制率达28.3%,其余各浓度无显著意义(见表1)。3.2影响b16-b6细胞和基底膜成分的粘附能力当归水提液在高、低浓度时分别有双向促进作用(见表2)。3.3影响b16-b6细胞的侵犯基底膜的影响当归水提液对B16-BL6细胞侵袭基底膜能力与对照组相比没有显著抑制作用(见表3)。3.4影响b16-b6细胞的承载能力当归水提液在高浓度时能显著抑制B16-BL6细胞穿越基底膜的运动能力(见表3)。3.5两组肺转移率比较连续给药35天,小鼠的免疫功能似有降低但无显著影响。至3周时,给药组小鼠接种瘤液侧后肢原发灶及患肢肿胀程度与对照组相比似有促进作用,但无统计学意义(见表4)。解剖观察发现:对照组100%发生肺转移,而当归高、低剂量组肺转移率分别为77.8%和33.3%;统计学检验显示,与对照组相比,当归低剂量组的肺表面结节数显著减少,结节体积明显减小,肺转移程度减轻(见表5、表6、表7)。4水提液的受制作用恶性肿瘤细胞的转移是一个多步骤的复杂过程。在此过程中,肿瘤细胞与基底膜或细胞外基质粘附,然后释放和激活多种蛋白水解酶降解基底膜和细胞外基质,在趋化剂、自分泌及旁分泌生长因子等作用下迁移到靶组织,克隆增殖从而形成转移灶。阻断肿瘤细胞粘附、侵袭和运动过程的各个环节均有可抑制肿瘤的转移。粘附是肿瘤细胞侵袭的始动步骤。肿瘤细胞通过膜表面受体粘附于基底膜及胞外基质成分FN和LN等。高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的粘附能力通常增高,这样有利于肿瘤细胞与肿瘤母体分离。另外,在肿瘤转移形成过程中,肿瘤细胞侵袭基底膜以及趋化剂运动也是重要的环节。实验结果表明,在13.33mg/ml浓度时,当归水提液能显著抑制B16-BL6细胞与基底膜成分LN的粘附,显著抑制B16-BL6细胞趋向FN运动的能力。B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型是将具有高转移能力的B16-BL6细胞移植于动物局部,瘤体增殖生长后,侵袭周围正常组织和血管,进入血循环,到达远处部位发生肿瘤转移。此模型可反映出肿瘤细胞侵袭、血行散播、侵