柿树炭疽病菌室内接种试验初报

柿树炭疽病菌室内接种试验初报

卡其色胺病是由卡其色胺菌colutopsispenz感染的。这在浙江淳安地区导致了无核柿子枝条、叶片腐烂、整株死亡，严重损害了当地柿子产业的发展。在自然条件下，柿树炭疽菌表现有一定的寄主专化性，只侵染无核柿DiospyroskakiThunb.，（一个当地品种）、野柿Diospyroskakivar.sylvestrisMakino和冬柿DiospyroskakiThunb.，(一个当地品种)，而不侵染浙江柿DiospyrosglaucifoliaMetcalf。前期对柿树炭疽病菌侵染无核柿的研究发现，附着胞的形成多发生在沟底即背斜细胞壁间结合处（ajunctionsofanticlinalcellwalls,JACWs）或近沟底（张敬泽和胡东维，2004）,然而还不能确定这种现象对不同柿树种间和品种间是否具有共性及其与寄主专化性的关系。深入研究柿树炭疽病菌在不同柿树（种和品种）上附着胞形成特性及侵染过程的细胞学，可为探索柿树炭疽病菌寄主专化性的机制及病害防治提供依据。1材料和方法1.1新梢的观察和观察在柿树炭疽病害发生时（2003年5月上旬），从浙江淳安地区无核柿上采集产生病斑不久的新梢，以及病梢周围表面健康的新梢。采集健康的新梢时，选择不同地点的10个柿树，剪取时标记枝条对着病枝的部位，每树剪取3个新梢。病梢带回室内后，将产生病斑的枝条保湿16～24h，让病斑产生大量的分生孢子团，其分生孢子用于接种试验；表面健康的新梢、叶柄和叶片用于细胞学观察。上一年冬季从浙江淳安地区选取健康的无核柿树、野柿、冬柿和浙江柿苗，移栽在盆中，带回后放置在温室中，等新梢抽出后供接种使用。1.2滤纸保湿性能试验从健康的盆栽苗上剪取无核柿树、野柿、冬柿和浙江柿新梢、叶柄和叶片，用灭菌水对样品清洗3次，分别置垫有滤纸保湿的容器中，每个容器置5个样品。接种试验分为两个组，一组进行症状观察，另外一组用于细胞学观察。用移液枪取孢子悬浮液（105～106个孢子/ml）分别滴加在不同的样品上，以滴加灭菌水的样品为对照。每个处理重复3次,将容器置于25°C培养箱中黑暗培养。不同时间观察病害症状和取样处理。上述试验重复2次。1.3观察方法及过程接种处理后不同时间（48h,60h,72h,90h）取样，用刀片削取枝条接种处表皮组织(0.3×1.0cm)和叶柄表皮组织(0.2×1.0cm)，用剪刀剪取接种处的叶片(1.0×1.0cm)，采用修改的Latunde-Dada(1996）方法处理样品，即用脱色液脱色（0.15%的三氯乙酸(W/V)溶解在3∶1(V/V)的乙醇与氯仿混合溶液中）脱色14h，然后用0.025%苯胺蓝乳酚油染色2h，用蒸馏水冲洗样品，制片。显微镜下观察附着胞形成和侵染过程。附着胞形成的位置划分为3种类型：(A)在柿树表皮背斜细胞壁间结合处（JACWs）上(横跨两个表皮细胞)；(B)近JACWs处（附着胞接近结合处，只与一个细胞表面接触)；(C)远离JACWs处（图1）。24h后，分别统计不同寄主表面附着胞形成的位置和数量。同时在不同时段观察炭疽菌侵染钉的形成以及初生菌丝和次生菌丝的形成和扩展。观测和摄影是在Axioskop2Plus显微镜Axiovision3.1图象处理系统上进行的。上述试验重复2次。1.4组织病理学观察从田间采集的样品上，削取枝条上标记的表皮组织（0.3cm×1.0cm）和叶柄正面表皮组织（0.2cm×1.0cm），每枝条上各取3块组织和3块叶柄组织，进行组织透明处理，按照修改的Latunde-Dada(1996）方法进行（同上）。每个枝条上取3张叶片，每张叶片用剪刀剪取含有主叶脉、侧叶脉和无叶脉的不同部位，叶片块大小为1.0cm×1.0cm，显微镜下观察。所用的设备同上。2结果与分析2.1田间自然发病情况的比较接种60h后，无核柿树和野柿新梢枝条上有肉眼可见的针尖大小病斑，但无核柿树枝条上症状较明显;无核柿树叶柄上也有肉脸可见针尖大小的病斑，野柿叶柄上则无病斑；其余处理和对照都无症状。72h后，无核柿树枝条上许多小病斑就相互连成大病斑或成一片，而无核柿树叶柄和野柿枝条上仅产生典型的圆形或卵圆形病斑，大小1～2mm（图2,A、B）；其余处理和对照都无症状。90h后，无核柿树枝条和叶柄上成片病斑产生粉红色分生孢子堆，但野柿枝条上未见分生孢子堆出现，其余处理对照都无症状。随着时间的延长，无核柿树枝条、叶柄和野柿整个枝条都变成黑褐色，侵染的野柿枝条出现粉红色分生孢子堆，而其余处理对照仍然无症状。在田间自然条件下C.gloeosporioides侵染无核柿新梢、叶柄、叶脉和果实，仅侵染野柿新梢和冬柿果实，而不能侵染浙江柿的枝条、叶柄、叶片和果实。室内接种试验与田间自然发病结果一致，说明C.gloeosporioides具有寄主专化性，只能侵染无核柿、野柿和冬柿，而不能侵染属于不同种的浙江柿。在寄主不同品种间（无核柿、野柿和冬柿），炭疽菌侵染部位有一定的专化性。2.2无核柿病附胞室内人工接种24h后，无核柿树、野柿、冬柿和浙江柿新梢、叶柄和叶片表面上均有炭疽菌附着胞形成。附着胞正面圆形或卵圆形，表面光滑，直径为8.2～9.0µm。附着胞形态及形成数量在不同柿树上无明显差异。统计结果显示，附着胞主要产生在JACWs处上或近JACWs处（图2D），百分率达81%～93%,其中在JACWs处上附着胞形成百分率为41%～51%，而近JACWs处为36%～42%，而产生在远离JACWs处的百分率仅7%～19%（表1）。统计分析也表明，无核柿叶柄上附着胞产生在JACWs处上的百分率最高，达53%，但与野柿叶片、野柿枝条、浙江柿叶柄、冬柿叶片、野柿叶柄和冬柿叶柄上的百分率无显著差异，而与其余处理有显著差异；其次，附着胞无核柿枝条上的百分率为46%，且与浙江柿枝条和冬柿枝条上附着胞百分率无差异；相比较，附着胞在无核柿叶片和浙江柿叶片上百分率都最低，为41%。附着胞产生无核柿枝条上近JACWs处的百分率最高，为41%，然而，仅与野柿叶片上的有显著差异，而与其余处理无显著差异。同一寄主不同部位上,附着胞形成表现为多样性。附着胞在野柿的枝条、叶柄和叶片上形成在JACWs处上和近JACWs处上的数量之间分别都无显著差异；附着胞在无核柿和浙江柿的枝条、叶柄和叶片上产生在JACWs处上的数量之间有显著差异，但在近JACWs处上的数量之间无差异；附着胞在冬柿叶柄和叶片上形成在JACWs处上的数量之间无差异，但都与枝条上的数量有显著差异，而在近JACWs处上的数量之间都无差异。田间自然接种情况下，柿树枝条、叶柄和叶片表面均发现有炭疽菌分生孢子，但只有枝条和叶柄表面有附着胞形成，且数量都很少。枝条表面80.50%～85.87%的附着胞形成在JACWs处上或近JACWs处，个别附着胞已有侵染钉形成。叶柄表面82.67%～89.67%的附着胞形成在JACWs处上或近JACWs处。叶片表面仅凹陷的侧叶脉中有分生孢子存在，未见萌发和附着胞形成。田间寄主表面附着胞形成特性的观察结果基本和室内观察结果一致，进一步证实在不同环境条件下附着胞在寄主表面形成的特性是相似的。2.3侵性丝的观察接种12h后，除浙江柿叶片样品仅观察到1～2个附着胞形成外，其余样品上都能观察到大量附着胞形成。黑色附着胞单个或成堆，但未观察到侵染钉的形成。24h后，不同柿树上都观察到附着胞中部有一黑色边缘的小圆点，是刚刚形成的侵染钉(图2D)。36h后，无核柿枝条、叶柄中观察到侵染菌丝，而其余处理均未观察到侵染菌丝的存在。48h后，无核柿枝条、叶柄中观察到膨大的初生菌丝和产生于初生菌丝上较细的次生菌丝，同时还观察到初生菌丝扩展到相邻细胞中，这和原先电镜观察的结果一致(张敬泽等，2003)；此时，野柿枝条中也观察到侵染菌丝，而其它处理中都未观察到侵染菌丝的存在。60h后，无核柿枝条、叶柄中都有分枝的次生菌丝向周围细胞中扩展；野柿枝条表皮细胞中存在膨大的初生菌丝和较细的次生菌丝(图2C)，但初生菌丝局限在最初侵染的细胞中，没有向周围的细胞中扩展，次生菌丝在细胞内扩展分枝，或侵入相邻的细胞中；其余样品中都未观察到侵染菌丝的存在。72h和90h后，无核柿叶片、野柿叶柄、野柿叶片和冬柿和浙江柿枝条、叶柄和叶片的表皮细胞中都没有观察到侵染菌丝的存在，但90h后，在不同的处理中多数附着胞出现凹陷或皱缩，这也和原先扫描电镜观察的结果相似(张敬泽和胡东维，2004)。3讨论3.1地面诱导附着胞形成附着胞是一些真菌专化性的侵染结构，诱导附着胞形成的信号一直是植物病理学所关注的问题。不同柿树表面附着孢形成位置的统计分析表明附着胞主要产生在JACWs处上或近JACWs处（产生在JACWs处上的数量略高于产生在近JACWs处的数量），而在远离JACWs处的数量最少，这是在不同柿树不同部位表面附着胞形成的共性。这也说明柿树炭疽菌附着胞形成没有专化性的寄主表面诱导，而具有寄主专化性的锈菌，人工基质上的专化性地貌信号可诱导附着胞形成(Allenetal.,1991;Collinsetal.,1997;Hochetal.,1987;Readetal.,1997)。对Colletotrichum属的不同种，地貌信号是否参与了附着胞形成有完全不同的报道(Winburne,1976;Lapp&Skoropad,1978)。事实上，越来越多的证据表明，附着胞形成是多个环境信号共同作用的结果,例如寄主表面的化学物质也参与了诱导锈菌附着胞形成(Readetal,1997)，单独地貌信号诱导附着胞形成的效率是很低的(Allenetal.,1991)，而化学物质和地貌信号协同作用的效果都远远高于单独诱导的效果(Collinsetal.,2001)；而在炭疽菌中，没有适当的方法证实地貌信号参与了附着胞形成。有人认为孢子可能在重力和漂浮作用下沉积在寄主或人工叶片复制品背斜细胞壁间结合处(Dean,1997)。然而，在我们的前期研究和本研究中发现：一些分生孢子产生很长的芽管，芽管可以纵向沿着表皮细胞顶部或细胞壁间结合处延伸，也可横向通过表皮细胞顶部和细胞壁间结合处延伸，但附着胞的形成却发生在细胞壁间结合处，这显然不是单独的重力的影响的结果，推测地貌信号也可能参与了附着胞形成。3.2不同柿树炭疽菌感染钉的关系炭疽菌属Colletotrichum是植物病原真菌中很重要的属，在世界各地都有炭疽病害发生的报道，尤其是在热带和亚热带地区。其中Colletotrichumgloeosporioides具有广泛的寄主范围，可侵染多种植物(Bailey&Jeger,1992)。但室内接种试验和田间观察结果证明侵染柿树的Colletotrichumgloeosporioides具有寄主专化性，不同柿树种间表现为具有严格的专化性，但在柿树种内的不同品种间仅具有侵染部位的专化性。柿树炭疽菌的分生孢子在不同寄主表面都产生附着胞，显然附着胞形成的位置与感病的寄主和非感病寄主无关，而只与植物表面地貌相关。侵染钉形成也似乎与寄主专化性无关，因为24h后不同寄主不同部位表面都有侵染钉的形成。但侵染钉的发育只能在感病寄主（无核柿、野柿、冬柿）专化性部位上发生，侵染钉侵入寄主细胞后产生初生菌丝和次生菌丝；但在非感病寄主（浙江柿）和感病寄主非专化性部位上侵染钉处于静止状态，类似于侵染鳄梨果实的胶孢炭疽菌的静止侵染(quiescentinfection)(Rusky,1996)和香蕉果实上的失活(Muirhead&Deverall,1981)。胶孢炭疽菌的分生孢子在鳄梨果实上萌发，产生附着胞，附着胞产生短的侵染钉，侵入表皮细胞，然后侵染钉处于静止状态，直到果实成熟后产生乙烯，诱导侵染钉发育；而香蕉炭疽菌C.musae(Berk.&M.A.Curtis)Arx.在不成熟的果实上虽然有黑色附着胞形成，但不产生侵染钉，附着胞处于失活状