人脐带血可成为间充质干细胞新来源的分子机制研究

人脐带血可成为间充质干细胞新来源的分子机制研究

中间细胞（msc）是一个非全日制干旱患者，具有多向分化潜力，可以通过外部分裂生长和扩大，遗传背景稳定。它是组织工程中种子的重要细胞之一。MSCs的来源广泛,成人骨髓、成人外周血、人脐带血(humanumbilicalcordblood,HUCD)、胎盘等均发现有间充质干细胞存在。MSCs易于外源基因的表达,而且MSCs所携带的外源基因表达具有明显的组织特异性,因此MSCs有可能成为一种新型的基因治疗的靶细胞。而脐带血来源相对于骨髓来源的MSCs更为原始、免疫原性低,功能更为强大,采集更为简单且无损伤,两者又有相同的生物学特性和免疫表型,可帮助鉴别筛选HUCDMSCs,并使之可能成为一种新的MSCs来源。已有研究报道MSCs可以追踪神经源性肿瘤细胞,这种对肿瘤的趋化特性可以治疗肿瘤的卫星病灶。因此MSCs有望成为肿瘤基因治疗的理想转基因载体。本实验旨在探讨HUCD可否作为MSCs的又一重要新来源,MSCs对卵巢癌细胞是否存在趋化作用,为卵巢癌基因治疗的靶向载体的发现奠定基础。数据和方法1.材料表面(1)然产孕产妇及孕产妇模型脐带血:选取哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科足月健康的自然产孕妇,征求其同意,无菌操作获得脐带血50ml,20U/ml肝素抗凝,4℃冰箱保存,12h内分离;细胞株:人卵巢上皮癌HO-8910细胞株由哈尔滨医科大学遗传教研室提供。(2)荧光标记鼠抗体paisIMDM(Gibco,Paisley,USA);胎牛血清(Gibco,Paisley,USA);淋巴细胞分离液(Ficoll,天津TBD公司);荧光标记鼠抗人抗体CD13-FTTC、CD14-FTTC、CD29-FTTC、CD34-FTTC、CD44-FTTC、CD45-FTTC、CD105-FTTC(BD,USA);N2培养基(Gibco,Paisley,USA);胰酶消化液(碧云天公司);Millicellinsert(Millipore,Billerica,MA,USA)其他试剂仪器由哈尔滨医科大学附属第二医院科研实验中心提供。2.方法(1)传统诱导培养系统完全培养液:IMDM+10%或者20%胎牛血清+1%青链霉素,pH值7.2±偏酸性;脂肪诱导培养系统:1%N2培养基+IMDM;成骨诱导培养系统:传代培养液+10-8mol/l地塞米松+10mmolβ-甘油磷酸钠+50mg/l维生素C,pH值7.2;油红O储存液:油红干粉0.5g+100ml异丙醇,60℃水浴,玻璃棒搅拌至完全溶解,密封4℃冰箱保存。(2)细胞培养和分离脐带血与PBS缓冲液1∶1混匀稀释后,以2∶1体积将稀释液缓慢叠加于人淋巴细胞分离液上,2000r/min离心20min,收集乳白色云雾状单核细胞层。PBS稀释洗涤收集液2次,800r/min离心5min,收集细胞沉淀,加入含20%胎牛血清的完全培养液,制成细胞悬液,以5×106/ml密度接种于25cm3塑料培养瓶中(Corning,USA)。置于37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中,2-3天半量换液,5-7天全量换液,去除未贴壁细胞,以后每3天换液,去除杂细胞。4-5周细胞融合达80%-90%,适时传代。用胰酶消化液1∶3传代,利用破骨样细胞与MSCs对其敏感性不同,可粗略分离。HO-8910复苏后,加入含10%胎牛血清的完全培养液接种于25cm3塑料培养瓶中置于37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中,1-2天半量换液,3-4天全量换液,去除未贴壁细胞,以后每2-3天换液。细胞融合达80%-90%时1∶3传代。(3)赫sdmsc和ho-8910的生物学形态于倒置显微镜下观察,拍照。(4)成骨细胞诱导培养脂肪细胞诱导:取P3代HUCDMSCs,以105/ml密度接种于6孔板,待细胞贴壁后加入脂肪诱导培养系统,诱导2-3周,每3-4天换液1次,倒置显微镜下观察。适时油红O染色法染色,显微镜下观察脂肪滴。成骨细胞诱导:取P3代HUCDMSCs,以5×103/cm2密度接种于6孔板和直径60mm培养皿中,分别加入成骨细胞诱导培养系统,每周换液2次,诱导1-3周。诱导后利用钙沉积法观察。以上诱导均设置未诱导组做空白对照。(5)荧光标记大鼠抗人抗体检测分别取P1、P3、P10代HUCDMSCs制成106/ml的细胞悬液。每管加入500μl细胞悬液,再加入荧光标记鼠抗人抗体CD13-FTTC、CD14-FTTC、CD29-FTTC、CD34-FTTC、CD44-FTTC、CD45-FTTC、CD105-FTTC,同时设计1管空白对照组,于4℃孵育30min。PBS洗去未结合抗体,流式细胞仪分析。(6)mscs的制备HO-8910、MSCs和空白培养液分别置于Millicell下层,MSCs置于上层,共用培养液,37℃,5%CO2饱和湿度培养箱中共培养48h。在MSCs一侧的聚碳酸酯薄膜上HE染色,光镜下任选5处计细胞数,试验重复3次。(7)统计分析采用SPSS12.0统计软件,实验数据以x¯±sx¯±s表示,统计方法采用方差分析,P<0.05为有统计学意义。结果1.hucdmscs的分离和鉴定HUCDMSCs于3-7天贴壁,10天左右出现细小棒状初始细胞形态,细胞核清晰,边界清楚,细胞逐渐变长,有些带有多个分支,胞质逐渐饱满。经换液和偏酸性培养基的筛选,及传代筛选,HUCDMSCs于P3代镜下未再出现非MSCs形态细胞,贴壁细胞均呈长梭形按一定极性的旋涡状生长(图1)。HO-8910细胞复苏成功,生长状态良好(图2)。2.成骨细胞诱导脂肪细胞诱导分化7天后大量细胞内可见融合成团的脂肪滴,对照组未出现脂肪滴,油红O染色阴性。成骨细胞诱导3周时可见黑色矿化结节沉积,阴性对照无变化。成功的在体外将HUCDMSCs诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞(图3、图4)。3.dmscs细胞表达流式细胞仪分析结果表明,CD29、CD44、CD105在HUCDMSCs细胞为阳性表达,而CD13、CD14、CD34、CD45为阴性(图5)。免疫表型特点不随细胞传代增加而改变,结果证明HUCDMSCs与骨髓来源的MSCs有相同的细胞表面标记。4.聚碳酸酯薄膜收集各组聚碳酸酯薄膜,HE染色,镜下计数。MSCs组,MSCs迁移到聚碳酸酯薄膜上的数量是113.33±8.96。空白培养液组数量是98.67±10.34。而HO-8910是519.67±19.96(图6)。数据显示人MSCs对HO-8910有趋化作用(P<0.05)。细胞生物学特性MSCs是近年来干细胞生物学研究中发现的重要细胞之一,它存在于多种组织中。2000年,Erices等首次报道了MSCs可以从HUCD中分离培养出来,但是在试验中的29例样品中,只有7例表现为间充质样细胞,其免疫表型和功能特点与骨髓来源的MSCs极为相似,其余均为破骨样细胞,因此存在诸多争议。随着HUCDMSCs的研究越来越多,科技的进步和方法的优化,大家的结论也趋于一致,认为HUCD中存在MSCs,但是比例远不及骨髓中的含量。MSCs是混合细胞群,目前还没有找到它特异的抗原标记,鉴定它主要根据其形态、功能等。1991年,Canplan把从骨髓中提出的可以在体外高度扩增,并可多向分化的细胞群命名为MSCs,这组细胞形态呈长梭形成纤维样的细胞,按一定极性漩涡状生长。1997年Pittenger等发现骨髓来源的MSCs可以在体外不同分化条件下诱导形成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。这种多能分化功能,充分证明了骨髓MSCs是一种多能干细胞。许多研究表明,MSCs的免疫标记特点是,SH2(﹢)、SH3(﹢)、CD29(﹢)、CD44(﹢)、CD71(﹢)、CD90(﹢)、CD105(﹢)、CD106(﹢)、CD120a(﹢)、CD124(﹢)、CD166(﹢);而CD34、CD45、CD177等造血细胞表面标记为阴性,HLA-DR、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40等与移植免疫排斥相关的表面标志均为阴性。已有研究报道神经干细胞可以追踪扩散的神经胶质瘤细胞,这种对肿瘤的趋化特性可以治疗肿瘤的卫星病灶。相关研究表明,干细胞对肿瘤具有趋化作用。因此间充质干细胞有可能成为肿瘤基因治疗的理想转基因载体。以MSCs作为基因治疗的靶向载体进行的研究,国内外偶见报道。实验成功从HUCD中分离出MSCs,无论在生物形态、体外诱导分化能力还是免疫表型上都与骨