薇甘菊柄锈菌生物学特性及寄主专化性研究

薇甘菊柄锈菌生物学特性及寄主专化性研究

b.k.mikanamircanhah。b.k.k.m，外来植物。它现在广泛分布在东南亚，位于中国广东省南部沿海地区的低山地区、沿海岛屿和香港，这造成了巨大的危险。现在，它正在珠江三角洲广泛扩散，对广东省福田市维森岛国家级自然保护区构成了重大威胁。控制薇甘菊的蔓延并进行有效、彻底的防除,已成为我国南方当地政府和人民的迫切需要,同时也是面临的重大难题。根据文献记载,薇甘菊柄锈菌(Pucciniaspegazzinii)可侵染假泽兰属的多种植物,产地从美国南部,经墨西哥直到阿根廷北部。根据国际农业与生物科学研究中心(CABI)的调查,这种柄锈菌在哥斯达黎加、巴西、厄瓜多尔、特立尼达岛、多巴哥岛,甚至远到秘鲁南部都有分布。为及时有效地控制薇甘菊进一步的蔓延与扩散,我们与英国CABI外来入侵生物防治研究中心合作,于2003年开始进行引进薇甘菊柄锈菌防治薇甘菊的研究工作。现将薇甘菊柄锈菌生物学特性和寄主专化性的研究结果报道如下。1材料和方法1.1薇甘菊柄锈菌分离培养薇甘菊采自广东内伶仃岛,用扦插法在温室(20~30℃,光照12h/d)中扩大繁殖。薇甘菊柄锈菌由CABI提供,保存在薇甘菊活体上,于本所的检疫温室(23±5℃,RH>80%)中扩大繁殖。固定液:95%乙醇∶冰醋酸(1∶1);透明液:饱和水合氯醛;染色液:含0.01%酸性品红,60%饱和水合氯醛,40%乙醇。1.2采用植物、甘菊和叶柄锈菌的繁殖方法1.2.1建立薇甘菊柄锈菌冬芽孢选具有2~3个分枝的健康薇甘菊植株置于接种箱中,在其叶片表面喷一层水雾,将带有成熟薇甘菊柄锈菌冬孢子的叶片或茎固定于其上方5~10cm,23±5℃、RH100%下培养24h。每处理接种5片叶片,3次重复。1.2.2不同薇甘菊植株与接种箱的相互作用将2~3个分枝的健康薇甘菊植株置于接种箱中,在其叶片表面喷一层水雾,再将带有成熟薇甘菊柄锈菌冬孢子的薇甘菊植株与之放在一起。其余同1.2.1。1.2.3菌种接种量的确定选带有成熟薇甘菊柄锈菌冬孢子的叶片或茎,用刀片轻轻将孢子刮下悬浮于灭菌的蒸馏水中,制成浓度为6.4×105个/ml菌悬液。设置4个不同的孢子接种量,分别为6.4×104、1.9×105、3.2×105、4.5×105个/ml。将不同浓度菌悬液接种于盆栽薇甘菊,每处理接种5株,每株接种5片叶片,3次重复。1.3从优甘菊柄锈菌的生活史出发按1.2中的3种方法接种后,在18~29℃、RH>80%的温室条件下培养,观察。1.4叶片的取样用悬挂法接种10株带有2~3个分枝、长势均匀的薇甘菊,每株2~3个接种点,12h后取样,以后每天取样一次,每次取3片叶,持续取7d。叶片经蒸馏水漂洗后去主脉及叶缘,剪成约5mm2置于固定液中固定24h后,转移到透明液中透明24h以上。将完全透明的叶片染色2~4h,水合氯醛褪色直至显色清楚。将叶片包埋在50%的甘油中于显微镜下检查。1.5不同乳液堆对薇甘菊顶芽的处理挑选直径约为1mm的成熟孢子堆,剪下悬挂于健康的薇甘菊顶芽上方5~7cm,设置3个处理,分别为1、5和10个孢子堆。每处理4次重复,每重复3个接种点(均为顶尖分生组织)。1.6美藻菊柄锈菌的起源分析用悬挂法接种7盆长势均匀的薇甘菊植株,在出现明显症状以前每天调查一次,出现明显症状后每星期调查一次,直至死亡。1.7供试植物及分组根据目标植物的分类学地位,采用Wapshere离心系统发生测定序列方法确定用于寄主专一性筛选的供试植物。选择了菊科管状花亚科各族的代表性植物种,其中有中国特有的与薇甘菊同属的假泽兰,与其潜在侵入地区(我国南方沿海地区)具有代表性的经济植物和观赏植物,共涉及29个科,62个属的72种植物(表1)。将供试植物分为12个组,每组设置6种植物和1个薇甘菊对照,3次重复,每种植物接种3株。采用1.2.1中悬挂法接种,参照英国CABI总部检疫温室制定的步骤和规则,观察时间为对照植物上完全表现出症状时间的两倍。用叶片染色技术观察测试植物叶片内菌丝扩展情况。1.8用植物法测定甘菊丝锈菌的外生生命力1.8.1不同浓度薇甘菊的接种用1.2.3方法制备冬孢子悬浮液(1.0×105个/ml),分装到4个1.5ml离心管中,于室温下分别放置4、7、10、15、25和30d,用涂抹法接种到健康薇甘菊上,以悬挂法接种薇甘菊为对照,以清水为空白对照。每处理接种4株,3次重复。1.8.2不同温度对薇甘菊生长发育的影响取带有成熟冬孢子的叶片20片,于30℃快速烘干,室温干燥条件下分别放置5、10、20和30d,观察孢子的变化情况,同时接种薇甘菊测定其致病力的变化。以新鲜带有成熟冬孢子的叶片为对照。每处理3次重复。2结果与分析2.1冬机构观察和冬芽孢杆菌萌发2004年7月-2005年2月,总计对75个样本进行了观察和统计。结果表明,在23±5℃、RH>80%的条件下,薇甘菊柄锈菌19~22d即可完成生活史。一般接种后3~7d出现肉眼可见的褪绿斑;12~15d出现症状的叶片背面开始产生冬孢子,冬孢子完全成熟需要1星期左右。成熟的冬孢子在湿度较低的条件下能存活2~3星期,一旦RH>80%,冬孢子即开始萌发产生担孢子。当遇到叶片表面存在露水时,冬孢子喷发产生的担孢子即可侵入,开始第二次侵染循环。担孢子侵入一般需要24h的露水期。2.2接种后，用伟甘菊丝吸取锈菌结果表明,接种薇甘菊柄锈菌48h后,植物组织内可观察到吸器,吸器形状不规则。随着接种时间的延长,吸器的数目明显增多。2.3从子堆数目对不同芽孢堆接种的成功率的影响用悬挂接种法研究了不同孢子堆数对薇甘菊的侵染能力,发现悬挂仅有一个孢子堆的叶片即可完成对薇甘菊的侵染,成功率为40%左右。随着孢子堆数目增加,接种成功率明显升高,5个孢子堆接种的成功率大约是单孢子堆的2倍,10个孢子堆接种的成功率达91.7%。说明薇甘菊柄锈菌具有很强的侵染能力。2.4柄锈菌二次感染,叶片死亡结果(图1、图2)表明,受薇甘菊柄锈菌侵染后,薇甘菊的生长明显受到抑制。在侵染早期薇甘菊生长非常缓慢,总叶片数在15d内仅增长了30%左右。随着时间延长,发病叶片数逐渐增加,到接种后15d时,50%以上的叶片感染锈病,达到第一次发病高峰。随着发病叶片上冬孢子的成熟,导致柄锈菌的二次侵染,45d时,达到第二次发病高峰,发病率为88%。柄锈菌侵入叶片后最终导致叶片死亡,同时成熟的冬孢子在适宜的温度以及高湿度下萌发导致再侵染,一些新生的叶片尚未展开即已死亡;一些幼嫩的枝条感病后,茎部发生缢缩而导致整个枝条死亡,致使总叶片数急剧下降。薇甘菊柄锈菌侵染薇甘菊后,虽然病叶率和叶片死亡率随时间延长而不断增加,但完全致死需要2个月左右。接种的7盆薇甘菊中有1盆在接种后57d死亡,2盆在第64d死亡,2盆在第71d死亡;共有5盆完全死亡,致死率为70%。2.5野生杂草假泽兰和设计植物的抗菌材料结果(表)表明:薇甘菊柄锈菌可在薇甘菊及其同属植物假泽兰上成功侵染,并可以完成侵染循环。在假泽兰上显示的危害症状与在薇甘菊上完全相同。野生杂草假泽兰又称米甘草,是中国原产物种。观察还发现,菊科植物天门冬、紫茎泽兰、向日葵、地胆草接种薇甘菊柄锈菌后,均产生褪绿斑;但显微镜下观察,在褪绿斑部位的组织和细胞内并未发现菌丝和吸器。说明对这几种植物并未发生真正侵染。薇甘菊柄锈菌是一种专化性很强的病原菌,可以安全的用于控制我国南方的外来入侵害草薇甘菊的危害蔓延。2.6叶片的通过对不同物质性的叶片染色结果表明,室温下放置15d后的冬孢子悬浮液对薇甘菊的侵染力明显下降,但仍具有一定的侵染能力,有30%~40%的叶片在接种后7~10d出现明显的褪绿斑。但放置20d后的孢子悬浮液即丧失浸染能力。3关于薇甘菊的致病性在检疫温室条件下,对薇甘菊柄锈菌生物学及其寄主专化性的研究结果表明,该菌对薇甘菊具有高度专化性,仅侵染薇甘菊和假泽兰