sdf-1xcr4轴在骨髓间充质干细胞中的趋化作用

sdf-1xcr4轴在骨髓间充质干细胞中的趋化作用

bmscs向损伤区的迁移糖尿病是一种严重威胁人类生活和健康的疾病。近年来许多研究发现通过静脉移植从骨髓提取培养的间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)可以迁移归巢到受损胰腺的部位参与组织修复以及促进再生,干细胞治疗已成为一种很有前景的治疗选择。然而BMSCs向损伤区迁移的具体机制目前尚不清楚。在生物、化学等因素的刺激下病变组织产生一系列理化改变并表达了一些能促使移植的BMSCs迁移到受损区域发挥作用的分子。如果我们能通过实验了解是哪些蛋白分子发挥了促进移植的BMSC向疾病组织区域趋化运动,对在今后的疾病治疗中使用BMSC有着非同寻常的指导作用。大量文献报道证明基质细胞衍生因子-1(Stromalcellderivedfactor-1,SDF-1)及其受体CXCR4在体内参与了多项生命过程,它不仅在内皮祖细胞、造血干细胞等的趋化迁移过程中起着重要的作用而且还与恶性肿瘤细胞的扩散转移有关。CXCR4在多种干细胞表面表达包括BMSC、造血干细胞、胚胎干细胞等。由此我们设计了以下实验旨在通过体外迁移体系观察BMSC在SDF-1/CXCR4轴作用下向受损胰腺组织迁移的相应改变,从而验证SDF-1/CXCR4轴在BMSC向受损胰腺组织迁移中的促进作用,并探索其分子机制。1材料和方法1.1实验动物健康SD大鼠购于第四军医大学实验动物中心,2-3月龄、体重220-250g,雌雄不限,清洁级,均在无特定病原体条件下饲养。1.2e生物技术DMEM-LG培养基、胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司),重组SDF-1因子(北京博奥森生物技术有限公司),FITCanti-ratCD29、FITCanti-ratCD34、PEanti-ratCD45、PEanti-ratCD90(美国eBioscience公司),链脲佐菌素(STZ)、AMD3100(美国Sigma公司)。1.3percol细胞分离和培养取2-3周SD大鼠颈椎脱臼处死,75%酒精浸泡消毒5min,无菌条件下取出股骨和胫骨,仔细分离并暴露骨髓腔,用注射器吸取无菌DMEM培养液反复多次冲骨髓腔,使骨髓内的细胞流出,200μm尼龙网过滤除去较大的组织团块。将收集的细胞悬液贴壁缓慢加入57%的Percoll细胞分离液上方,2000r/min离心10min,取培养液和Percoll细胞分离液的界面层细胞,接种到含有10%FBS的DMEM-LG培养基中,放置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养,72h后首次换液,以后每两天换液一次,当观察到细胞铺满培养瓶底80%以上时,按1:3传代培养,定期观察记录细胞形态。用0.25%胰酶消化后收集培养的第3代细胞,流式细胞技术检测细胞表面CD29、CD34、CD90、CD45的表达。1.4stz的制作SD大鼠5只(6-8周龄,体重220-300g),禁食不禁水12h,将STZ溶解于0.01mol/l柠檬酸三钠-柠檬酸缓液中(PH4.5)制成浓度1%的STZ液(65mg/kg)腹腔注射。自由饮食、饮水72h后出现多饮、多尿、多食症状持续一周,尾静脉取血测空腹血糖>16.7mmol/l为建模成功。1.5l-dmem法大鼠乙醚麻醉后,正中切口分离、切取胰腺组织,用PBS冲洗干净后立即放入液氮罐中保存。实验时将胰腺组织从液氮中取出称得一定的组织质量,用眼科剪充分剪碎后再放入到玻璃匀浆器中,按1ml/100mg的比例加入L-DMEM培养液,冰浴条件下研磨。收集匀浆后的组织,3500r/min离心10min,取上清液再用12000r/min离心20min,取上清液,滤器抽滤,-70℃下保存留备用。运用以上方法制备实验所需的正常大鼠胰腺组织提取液。1.6细胞活力检测取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞进行实验。0.25%胰蛋白酶消化后用含2%胎牛血清(2%FCS)的L-DMEM培养液将细胞密度调整为1×105/ml,让细胞在培养液中悬浮1h以恢复其功能及形态。将收集到的细胞分为6组(A~F组):A组为阴性对照组下室内加入含2%FCS的L-DMEM培养液0.5ml,B、C、D、E组的下室内分别加入含10、50、100、200ng/mlSDF-1的2%FCSL-DMEM培养液0.5ml,F组下室内加入含2%FCS+100ng/mlSDF-1L-DMEM培养液0.5ml。A~E组上室内均加入200μl细胞悬液,F组上室内加入与100μg/mlAMD3100共孵育30min后的细胞悬液200μl,将Transwell小室(滤膜孔径8μm)置37℃、5%CO2条件下孵育24h,取出小室,PBS淋洗,用棉签擦去硝酸纤维素膜内层上的细胞及杂质,在室温下浸泡在4%多聚甲醛中固定细胞15min,清洗后使用苏木精染色,每张滤膜在倒置显微镜观察并随机计数5个高倍镜(×400)视野下细胞数,取平均值。实验重复3次综合分析。1.7模型胰腺组织的培养按照以上的方法行胰腺组织提取液对骨髓间充质干细胞迁移趋化影响的实验。将消化收集的细胞分为5组((1)~(5)组),阴性对照组((1)组)在下室加入含2%FCS的L-DMEM培养液0.5ml;正常胰腺组织提取液组((2)组)在下室内加入正常胰腺组织提取液0.5ml;模型胰腺组织提取液组((3)组)在下室内加入受损胰腺组织提取液0.5ml;AMD3100+模型胰腺组织提取液组((4)组)在下室内加入受损胰腺组织提取液0.5ml;AM-D3100+正常胰腺组织提取液组((5)组)在下室内加入正常胰腺组织提取液0.5ml。(1)-(3)组上室内分别加入200μl细胞悬液;(4)-(5)上室内分别加入与100μg/mlAMD3100共孵育30min的细胞悬液200μl。1.8数据处理和统计方法实验数据均以表示,采用SPSS15.0统计软件进行分析,采用单因素方差分析,当P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1细胞的贴壁培养光镜下观察到骨髓中分离出大量的有核细胞悬浮于培养液中,培养72h后换液倒掉没有贴壁的细胞,培养可见呈集落生长的椭圆形、梭形贴壁细胞,部分呈三角形,胞核大清晰(图1A)。待细胞铺满培养瓶底80%以上时,按1:3传代,传至第3代时细胞形态均一,大部分呈长梭形,似成纤维样细胞,细胞界限清楚漩涡或平行排列,细胞生长迅速(图1B)。2.2造血干细胞标记物cd29、cd29流式细胞仪检测BMSCs表面标记高表达CD29、CD90,低表达造血干细胞标记物CD34、CD45,表达率分别为98.6%、99.7%、1.8%和5.0%(图2)。2.3sdf-1对be组迁移细胞数的影响用Transwell小室检测不同浓度SDF-1对骨髓间充质干细胞迁移的影响效果。实验数据显示在10、50、100、200ng/ml不同浓度的SDF-1条件下(B~E组)迁移细胞数分别为(13.33±1.15)、(19.67±3.06)、(25.33±2.89)、(25.67±4.04),较阴性对照组(A组9.00±3.00)差异有统计学意义(均P<0.05);随着SDF-1浓度的增加对骨髓间充质干细胞迁移的影响呈现浓度依赖性,SDF-1100ng/ml+AMD3100组的骨髓间充质干细胞迁移数为(10.67±4.04),与阴性对照组比较差异无统计学意义(图3)。2.4细胞间充质干细胞迁移数迁移实验结果显示(1)~(5)组骨髓间充质干细胞数分别为(9.33±2.08)、(9.67±3.21)、(26.33±3.79)、(19.67±3.79)、(10.33±3.06)。正常胰腺组织提取液组((2)组)与阴性对照组((1)组)相比较无统计学意义。糖尿病模型胰腺组织提取液组((3)组)与阴性对照组和正常胰腺组织提取液组相比较骨髓间充质干细胞迁移数均有统计学意义(P<0.05)。然而当骨髓间充质干细胞与100ng/mlAMD3100共孵育30min后((4)组),糖尿病模型胰腺组织提取液对细胞的趋化作用明显减弱,细胞迁移数显著下降。用100ng/mlAMD3100处理骨髓间充质干细胞((5)组)后结果显示并没有明显降低正常胰腺组织提取液对骨髓间充质干细胞的迁移影响(图4)。3细胞间充质干细胞的迁移归巢骨髓间充质干细胞(BMSCs)取材方便,免疫原性弱,增殖能力强,具有多向分化潜能,且利用BMSCs可进行自体移植,从而避免免疫排斥反应及伦理纷争,因此BMSCs成为干细胞组织工程的理想种子细胞。而且越来越多的实验证据表明BMSCs拥有免疫调节、抗炎、抗凋亡和营养的作用。本研究采用密度梯度离心法结合贴壁培养法获较得纯化的BMSCs,表面抗原CD29、CD90、CD106呈阳性,CD34、CD45为阴性。研究发现,组织受损或炎症时可分泌多种信号分子促进骨髓间充质干细胞迁移,这些分子包括细胞因子(G-CSF,granulocytemacrophagecolonystimulatingfactors(GM-CSF),stemcellfactor(SCF)),白介素(IL-7,IL-12,andIL-3),趋化因子(SDF-1,IL-8,Mip-1α,andGroβ)和生长因子(VEGF,hepatocyteandinsulin-likegrowthfactor(HGF),IGF)。SDF-1在其中起到重要的作用,SDF-1(CXCL12)是CXC趋化因子亚家族的成员之一,它对多种干细胞的趋化作用受到趋化因子受体CXCR4的调节、是己知的CXCR4的唯一配体。随着研究的深入SDF-1/CXCR4轴已成为探索干细胞迁移及归巢行为的重要环节。SDF-1/CXCR4轴在生命体内拥有有广泛的生理功能:不仅在循环系统、免疫系统及中枢神经系统的发育中起着关键的作用,还参与了HIV的感染、炎症反应、造血干细胞及肿瘤细胞的迁移等过程。本实验利用Transwell小室体外迁移法对骨髓间充质干细胞迁移归巢的相关机制做了初步探讨。实验结果显示,AMD3100可阻断SDF-1对骨髓间充质干细胞的诱导趋化作用,说明SDF-1在骨髓间充质干细胞迁移中起重要作用且在一定范围有剂量依赖性。在使用糖尿病模型胰腺组织提取液进行实验时骨髓间充质干细胞迁移数较正常胰腺组织提取液组和阴性对照组都显著提高,差异具有统计学意义,说明糖尿病胰腺组织中表达了某些特殊的蛋白分子或信号分子诱导了骨髓间充质干细胞的迁移过程,而这种效果作用能被SDF-1/CXC-R4轴特异性拮抗剂AMD3100明显抑制,提示SDF-1/CXCR4轴可能是糖尿病胰腺组织提取液中趋化骨髓间充质干细胞的主要因子。AMD3100虽然能明显抑制糖尿病胰腺组织提取液组对骨髓间充质干细胞的趋化作用,但是抑制后的