实时荧光定量pcr检测shh基因在不同周龄皮肤中的表达规律

实时荧光定量pcr检测shh基因在不同周龄皮肤中的表达规律

哈希霍g信号通道是与毛囊生长相关的信号通道之一。hegghog蛋白的编码基因包括shh、ih和dhh。shh是heggoog蛋白的主要编码基因。shh参与了毛发生长和毛发休止期的转化过程。Shh基因的功能受到Patched和Smoothened两种跨膜蛋白的调节,Patched蛋白既可以作为Shh配体的受体,也可以作为Smoothened蛋白的负调控因子。Shh前体蛋白经过剪切与修饰形成19kDaN端蛋白和25kDaC端蛋白,C端蛋白可以将胆固醇分子转移到ShhN端蛋白的C端,从而使N端蛋白的作用区域得到有效控制。长毛兔原名安哥拉兔,起源于小亚细亚一带,1723年由英国引进到法国,随后分布于世界各地,过去主要有英、德、法和中4个不同的品种。德系长毛兔引入我国后,主要用于改良中系长毛兔,在提高我国长毛兔产毛量和改进兔毛品质方面发挥了重要作用。目前,我国长毛兔养殖数量占世界的90%,兔毛产量占世界的95%以上。皖系长毛兔(WanstrainAngoraRabbit)是安徽省农业科学院畜牧兽医研究所历经20余年的系统选育而成,于2010年7月顺利通过国家畜禽遗传资源委员会新品种审定,并于当年获颁国家级畜禽新品种证书。皖系长毛兔的被毛特征是:全身绒毛厚密、洁白、光亮。被毛有毛丛结构,但不缠结,有明显波浪形弯曲。多有额毛,部分有颊毛,耳背有稀疏短毛,耳尖有一撮长毛。四肢、腹部密生绒毛;体毛细长柔软,排列整齐,全身枪毛稀少。比利时兔又称巨灰兔、弗朗德巨兔,是英国育种家用原产于比利时贝韦伦一带的野生穴兔改良育成的优良肉用兔。比利时兔被毛呈黄褐色或栗壳色,毛尖略带黑色,腹部灰白,两眼周围有不规则的白圈,耳尖部有黑色光亮的毛边,比利时兔被毛坚韧性较好,毛色具有天然光泽,皮张面积大,皮板的弹性和柔性好。目前相关研究证明Shh基因参与毛囊生长发育相关过程,但是对Shh基因的研究主要集中在人和鼠上,至今还无该基因在家兔上的相关研究。因此本试验以皖系长毛兔和比利时兔为试验材料,研究Shh基因在其皮肤组织中的表达规律,旨在初步探究该基因的表达情况与兔毛生长的相关性。1材料和方法1.1保养兔的制备皖系长毛兔和比利时兔的皮肤组织样均采自安徽省农科院种兔场,对母兔同期配种,同期产仔,所产仔兔饲养在同一环境条件下,分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22周龄每个品种选择健康公、母兔各3只,采集体侧部和臀部皮肤各2g左右,投入液氮中,后转入-70℃冰箱中保存备用。1.2荧光定量试剂盒Agilent安捷伦930882BrilliantIIISYBR,RNA提取试剂盒(Trizol)购自Lifetechnologies公司;DEPC和琼脂糖购自SIGMA公司;FastQuantRTKit(WithgDNase)购自北京天根生化科技有限公司;荧光定量试剂盒(DRR081A)购自大连TaKaRa公司;主要仪器包括Agilent安捷伦MX3000P荧光定量仪器,制冰机购自SM公司,超低温冰箱购自日本SANY公司,NanoDroPND-1000浓度测定仪购自美国GE公司,EPPendorffThermalCyclerPCR仪购自德国EPPendorf公司。1.3方法1.3.1荧光定量引物的设计与合成根据GenBank中家兔GAPDH和Shh基因的cDNA序列,利用Primer3.0设计两个基因的特异性荧光定量引物,引物由上海生物工程公司合成,引物序列见表1。1.3.2nanodropnd-100血清蛋白的检测利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测样本总RNA的完整性,并用NanoDropND-1000浓度测定仪测定RNA浓度,最终将每个RNA样本取出一部分稀释至100ng/μL,放入-70℃冰箱中保存。1.3.3周龄体侧部和下颌的rna反转录合成利用FastQuantRTKit(WithgDNase)(北京天根生化科技有限公司)将上述皖系长毛兔和比利时兔各个周龄体侧部和臀部的RNA反转录合成cDNA,按试剂盒进行反转录操作。1.3.4dna的制备实时荧光定量PCR试验20μL体系:上游引物1μL,下游引物1μL,模板cDNA1μL,SYBRPremix10μL,双蒸水7μL。反应程序为:95℃预变性10min;95℃变性20s,58℃退火30s,72℃延伸25s,共45个循环;95℃1min,55℃30s,95℃30s。1.3.5实时荧光定量pcr数据实时荧光定量PCR数据分析,先用EXCEL初步处理Shh基因的实时荧光定量PCR数据,相对定量的结果采用2-ΔΔCt算法进行处理(ΔΔCt=(待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct-对照组管家基因平均Ct值))。2结果与分析2.1蛋白含量测定1%琼脂糖凝胶检测总RNA的完整性,核酸蛋白测定仪测定浓度,稀释至100ng/μL,-70℃保存备用。由图1可知,提取的RNA28S、18S条带清晰,无明显降解。2.2周龄公兔林各周龄shh基因表达量以0周龄皖系长毛兔公兔臀部中Shh的表达量为内对照,采用2-ΔΔCt法计算Shh基因在皖系长毛兔不同性别、不同周龄、不同部位中的相对表达量。由图2可见,Shh基因在皖系长毛兔的整个生长发育过程中均有一定量的表达,除公兔体侧部外,其它均在0~2周龄呈上升趋势。母兔体侧部在4、8周龄的相对表达量较高,母兔臀部18周龄明显上调;10、14和18周龄公兔臀部Shh基因表达也较高,呈波动性,公兔体侧部0、18和22周龄Shh基因表达较高。公兔体侧部在0和22周龄的表达变化趋势与其他3组不同,表现为0~4周龄下降,20~22周龄上升的趋势。母兔体侧部在2~12周龄的变化趋势不同于其他3组,呈现“上升→下降→上升→下降→上升”的趋势。除4周龄和8周龄外,公兔体侧部的相对表达量显著高于其他3组,18周龄时,母兔臀部和公兔体侧部显著高于另外两组,其他组中,公母之间或者部位之间均差异不显著(P>0.05)。2.3建兔前兔的性别、周龄、部位分布以0周龄比利时公兔臀部中Shh的表达量为内对照,采用2-ΔΔCt法计算Shh基因在比利时兔不同性别、不同周龄、不同部位中的相对表达量。由图3可见,Shh基因在比利时兔不同周龄、不同性别、不同部位中相对表达量变化趋势基本一致,除公兔臀部0~4周龄呈现先下降再上升的趋势外,其他均表现为0~2周龄上升,2~8周龄下降,8~22周龄表达量相对较低,且变化幅度较小。3shh基因在发育的过程中的表达Hedgehog蛋白的编码基因有Shh、Ihh和Dhh基因,其中Shh是Hedgehog蛋白的主要编码基因,Shh参与调控毛囊生长和毛囊休止期向生长期转换的过程。Shh是毛囊在胚胎期时形态发生的必要信号分子,如果小鼠发生Shh基因突变,则不会出现皮肤上皮内陷,从而阻断胚胎期毛囊形态的发生。Mill等通过皮下注射的方式,给19日龄C57BL/6的小鼠注射腺病毒载体Shh,发现注射Shh处皮肤中Shh表达量增加,并刺激了处于休止期的毛囊加速进入生长期,2周后发现小鼠注射处皮肤新生毛发的速度比非注射处皮肤新生毛发速度快。据研究发现Shh参与内皮细胞的增殖、修复过程,Song等将环杷明(Shh的阻断剂)注射到小鼠胚胎中,发现明显影响了小鼠的血管细胞的增殖、分化。苏蕊等分析了Shh基因在内蒙古绒山羊皮肤毛囊发育生长期和休止期皮肤中的表达,结果显示:休止期的Shh基因表达水平是生长期的0.22倍。本研究中Shh基因在皖系长毛兔和比利时兔0周龄时均有一定的表达量,说明该基因在家兔胚胎期就开始表达,但是Shh基因在两个兔品种中的表达变化趋势并不完全一致,此结果可能是两个兔品种的经济用途不同导致的。除皖系长毛兔公兔体侧和比利时兔母兔臀部,其他6组在0~2周龄,Shh基因的表达量均呈现上升趋势,吴添文的研究表明:0周龄时,初级毛囊周围分布的次级毛囊数量较少,2周龄时,次级毛囊的数量明显上升,亚毛囊群中的次级毛囊数普遍为5~12个,即0~2周龄时,家兔的毛囊处于一个快速生长期,这与本研究的结果一致,说明Shh基因在毛囊生长旺盛期表达量相对较高。Shh基因在皖系长毛兔0~22周龄的表达量均相对较高,比利时兔0~6周龄时表达量相对较高,8~22周龄表达量相对较低且变化趋势较为平缓。皖系长毛兔为毛用型兔,其被毛生长较快且在整个生命过程均在生长,但比利时兔为肉用型兔,其被毛长到一定阶段,便开始缓慢生长,甚至停止生长。本研究结果发现Shh基因在比利时兔8~22周龄表达