第九章 生物芯片及数据分析技术

第九章生物芯片及数据分析技术在20世纪科技史时有两件事是值得大书特书的：

（1）微电子芯片，它是计算机和许多家电的心脏，它改变了我们的经济和文化生活，并已进入到每个家庭；

（2）DNA芯片，它将改变生命科学的研究方式，革新医学诊断和治疗，极大地提高人口素质和健康水平。

——美国《财富》杂志人类基因组计划人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）是一项国际性科学研究计划，旨在阐明人类基因组30亿个碱基对的序列，从物理和功能角度发现和定位人类基因组基因，破译人类全遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。对人类基因组的研究推动了整个生命科学的发展，同时也形成一门崭新的科学——基因组学（genomics），即研究基因组的科学。上世纪70年代，美国投入巨资的“肿瘤计划”搁浅，人们渐渐认识到，包括癌症在内的各种人类疾病都与基因直接或间接相关。1984年，美国能源部（DOE）首次探讨人类基因组DNA进行全序列分析的前景1986年美国生物学家、诺贝尔奖获得者杜尔贝科(R.Dulbecco)在《science》发表《癌症研究的转折点——测定人类基因组序列》（“人类基因组计划的标书”）得到热烈响应。1990年10月1日，人类基因组计划正式启动。2001年2月，人类基因组序列“工作框架图”公布2006年5月，最后一条染色体序列被公布2008年1月，个人基因组计划启动人类基因组计划主要研究内容以具有遗传多态性的遗传标记为位标、以遗传学距离为图距的基因组图。遗传学距离以厘摩（centi-Morgan,cM）表示。连锁的遗传标志之间的重组频率为1%时，它们的相对距离为1cM，相当于106bp(1Mb)。

遗传多态性标记为：RFLP、MS/STR、SNP。以一段已知核苷酸序列的DNA片段（称为序列标签位点，sequencetaggedsite，STS）为位标，对构成基因组的DNA分子进行测定，从而对某段DNA序列在染色体上的相对位置做一线性排列。以kb或Mb作为图距而绘制的基因组图。核苷酸序列图即最详尽的物理图。通过测序得到基因组的序列，是一般意义上的人类基因组计划。

GeneBank数据的快速增长人类基因组计划催生了大量生物数据怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成了全世界生命科学工作者共同的课题！传统核酸印迹杂交的局限性传统核酸印迹杂交：SouthernBlotting和NorthernBlotting等技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量(lowthrough-put)等对核酸序列分析与测定提出的新要求速度快、效率高高通量（可同时对大量核酸序列进行检测和分析）操作简便、自动化程度更高成本低生物芯片技术正是在这样的背景下应运而生。生物芯片技术定义：是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子、糖类甚至组织切片和细胞等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、滤膜等载体）的表面，组成高度密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样本中的靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。原理：分子间特异性相互作用核酸杂交抗原－抗体作用DNA－蛋白质间的识别作用等特点：高通量（一张芯片同时可分析千上万的分子）

微型化（可装入口袋）

自动化（技术自动化；结果分析自动化）

低成本（相对于同时进行大量分子研究而言）

防污染分类：生物芯片DNA芯片（基因芯片）蛋白质芯片组织芯片细胞芯片微阵列芯片芯片实验室（Lab-on-a-chip）：生物芯片技术发展的最终目标。——把生物、化学等领域中所涉及的样品制备、生物化学反应、分离检测等基本操作单位集成或基本集成于一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。

生物芯片技术流程第一节DNA芯片（DNAchip）又称为基因芯片（Genechip）或DNA微阵列（DNAMicroarray）。将大量已知的探针（寡核苷酸片段或DNA片段）固定于支持物上，然后与标记的样品DNA按碱基互补配对原则进行杂交（探针能够在基因混合物中识别出特定基因），最后通过检测杂交信号的强度及分布来对特定基因进行分析。基本环节：芯片制作样品制备分子杂交检测分析DNA芯片实验流程

DNA芯片制作就是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针通过一定的方法固定到固相支持物上。

主要有两种：原位合成法和直接点样法原位合成法和直接点样法的比较DNA芯片的基本构造1.支持物：如玻片、硅片、NC膜、Nylon膜2.探针：高密度的探针序列按照一定的次序固定在支持物上，每个位点的序列是已知的外观探针支持物剖面图平面局部放大DNAmicroarraysonglassslides样品制备（DNA、mRNA）——与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。生物素常用标记物：荧光素待测样品（用Cy3-dUTP标记）

对照样品（Cy5-dUTP）

以表达谱芯片为例：

提取样本组织细胞中的mRNA（样本要新鲜并有代表性）

对提取的mRNA进行纯化

逆转录合成cDNA（可进行PCR以提高灵敏度）

以双链cDNA为模板进行体外转录（荧光标记在此渗入）分子杂交——是已标记的样品与芯片上的探针进行反应后产生一系列信息的过程。与传统的核酸分子杂交相同，但要求更高：选择合适的反应条件、减少生物分子之间的错配率。

考虑杂交反应体系中盐浓度、探针GC含量和所带电荷、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、检测基因的二级结构的影响。

利用生物素标记的，在此染色（常用抗生蛋白链菌素-藻蓝蛋白）检测分析——利用专门的芯片扫描仪对杂交结果进行图象采集和分析。

荧光标记阳性杂交图基因芯片检测结果不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红〉黄〉绿〉兰〉紫DNA芯片技术的应用DNA测序：杂交测序（SBH）疾病诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达用药个体化分析：药物筛选：基因表达研究：利用DNA芯片进行杂交测序的原理杂交测序技术（SBH）可大规模地检测和分析DNA的变异及多态性。突变疾病诊断1、用于诊断遗传性疾病例：上海联合基因公司开发了β-地中海性贫血的检测芯片2、用于病原体的检出和确定例：西安联尔公司开发了呼吸道病原体诊断芯片，可检出多种引起呼吸道感染的病原体。3、肿瘤的基因诊断

例：Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。药物筛选利用DNA芯片技术可比较正常组织（细胞）与病变组织（细胞）中大量相关基因表达的变化，从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。应用DNA芯片还可直接筛选特定的基因文库以寻找药物作用的靶点。表达谱芯片是DNA芯片中最常用的一种芯片。Affymetrix基因表达谱芯片的实验流程

生物信息学分析——基因芯片读数实际上是扫描后的信号强度，是一种相对值。不同芯片之间要经过以看家基因作为对照的标准化处理才有可比性。常用GAPDH或β-actin基因归一化的数据1、差异基因的筛选倍数差异FoldChange=SignalA/SignalB（即待比较的两个标准化以后的信号相除所得的值）

——常用标准Ratio（0.5，2.0）显著性差异p值：进行统计学t检验，p<0.05为显著性差异，p<0.01为强显著性差异

——生物学重复不少于3个每个探针点的Flag值/Call值：表达谱芯片中常用A、P、M来表示该探针点信号与背景信号的差异

——A-Absent：无显著性差异

P-Present：有显著性差异

M-Marginal：差异介于A和P之间

——要求比较的两组，至少有一组内不出现A火山图（Volcanoplot）散点图（Scatterplot）视图分析

聚类分析将基因与最相关的表达谱放在一起，分析的基础是总基因组的线性相关。生物系统的有序性质可以保证聚类分析方法会揭示出生物行为的有趣特征。GO（GeneO