第四章分子生物学研究法修定版(13年)

第四章分子生物学研究法10/25/20231本章内容掌握：细菌转化；DNA序列测定；基因敲除；RNA干扰；酵母双杂交；cDNA文库了解：其他相关分子技术10/25/202321DNA相关技术

1.1细菌转化定义：一个细菌细胞摄入并表达外源DNA的过程(书上：指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的？DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程)（1）CaCl2法转化过程中的受体细菌应是限制修饰系统缺陷型菌株并且0℃低渗CaCl2处理成感受态。通过短暂的热刺激（42℃）可以使细菌摄入外源DNA（2）电击法（电脉冲导致细胞膜凹陷随着跨膜电压的增加造成疏水性孔洞变为亲水性孔洞）10/25/20233*外源基因在细菌中的表达目的基因体外扩增（PCR若是真核需从CDNA文库扩增或cDNA为模板扩增）（见问题）与载体连接（酶切）（双酶切，单酶切）（表达载体/克隆载体、多克隆位点-包含多个(最多20个)限制性酶切位点(restrictionsite)的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头(polylinker),是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列）转化筛选（质粒抗性标记，蓝白斑*，（菌落PCR）诱导表达10/25/20234

蓝白斑筛选的原理:载体含lacZ的调控序列和N端。宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的。（lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补）。由α-互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。10/25/20235计算插入频率:白色菌落数/(白+蓝)菌落数转化频率：每ugDNA转化菌落数10/25/202361.2基因文库（cDNA文库）的建立genebank（library）：一个含有基因组各个DNA片段的克隆的集合。cDNA：以mRNA为模板在逆转录酶作用下形成的DNA。cDNA有组织特异性（都是该组织细胞现在表达的基因）cDNA文库：以mRNA为基础在逆转录酶作用下，逆转录出DNA克隆形成的集合10/25/2023710/25/20238cDNA文库的建立1.高质量的mRNA的制备利用3’polyA尾巴，将用生物素标记的寡聚（dT）引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚（dT）引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA10/25/20239②mRNA体外合成DNA(反转录)使用无Rnase活性的反转录酶（防止降解mRNA）在反转录系统中加人寡聚（dT）及随机引物R6，以保证得到全长cDNA应选用活性较高的反转录酶及甲基化dCTP，保证所获得双链cDNA的方向性（第一条链甲基化，两端不同的酶切位点以保证第一条链与另一条链区别开。编码表达蛋白的是哪条链?）10/25/20231010/25/20231110/25/202312③克隆在组织和培养的细胞中，各种mRNA的含量是极不相同的，根据mRNA分子含量的多寡（丰度）可以将mRNA划分为高丰度、中丰度和低丰度3种不同的类型10/25/202313克隆数量与涵盖概率有如下关系N=ln(1-P)/ln(1-1/n)N:克隆数P：某个基因被文库所包含的概率（要求大于99%）1/n：每一种低丰度的mRNA占总mRNA的分数。则根据表中数据，cDNA文库所需要的最少克隆数为cDNA文库的构建可以保证大规模测序等基因组学研究10/25/2023141.3SNP技术SNP单核苷酸多态性分子构象由于碱基的不同在电泳或高效液相检测中移动性不同作用解释不同个体对药物敏感性差异犯罪身份，亲子鉴定，器官移植配对筛选10/25/20231510/25/2023161.4核酸序列分析人工法：适用于小片段DNA,需要放射性物质，安全性低酶法（Sanger），又称合成法、末端终止法、双脱氧法化学法（Maxam和Gilbert）自动法：适用于较大的片段序列自动分析仪**最新方法：1.来自斯坦福大学应用物理学系的研究人员在2006年8月11日的Science杂志上发表文章，介绍了一种利用单个RNA聚合酶分子运动的DNA测序新方法，受到各方的关注。2.2011年2月韩国浦项工学大学化学学科金光秀教授发明的新方法（见下页介绍）10/25/2023171研究人员发现在转录中核苷酸将限制转录的速度，聚合酶会在稀有碱基的位置上停滞不前。利用一种能够分辨碱基对的超稳定捕捉装置（ultrastableopticaltrappingapparatus）监控四种核苷酸的数量受限情况下的转录。从转录暂停记录的排列模型分析中，我们能够确定DNA的序列。该原理的证据证明核酸酶的前进可以用来直接提取DNA序列的信息。

2韩国浦项大学化学学科金光秀教授研发出了一种高速DNA破译方法，可以利用拥有碳原子层的石墨带状体阅读30亿对DNA碱基。当带着人类基因信息的DNA通过纳米大小的小孔的时候，四种DNA碱基都会接触石墨带状体大约1微秒，这样就可以观察DNA碱基接触石墨体后，石墨体导电性能的变化。这些信息变化就可以由一台电脑收集，在短短一个小时之内就可以对DNA进行测序。金教授的研究成果不仅仅缩短了测序的时间，而且大大削减了DNA测序成本。

10/25/2023181.4.1末端终止法原理：DNA聚合酶能够利用单链DNA作为模板准确合成互补链双脱氧的核苷酸可以掺入寡聚核苷酸的末端，但会终止链的继续延伸（？）步骤：模板分为四份，每份均加入引物，聚合酶和底物核苷酸，其中一种核苷酸进行放射标记（如动画中放射性标记A（黄色表示）；（生化书，偶然性）；加入放射性标记的引物（M13）四份分别加入不同的双脱氧核苷酸，给于适当的条件进行体外合成合成结果进行电泳，通过电泳条带读出核苷酸顺序动画10/25/2023191.4.2.化学法（直读法）原理：利用不同化学试剂对DNA中的碱基发生作用，而后在哌啶的作用下切断核苷酸链，产生大小不同的特异DNA片段DMS（硫酸二甲脂）中性作用G（DMS在中性环境中使G上N7位甲基化，后鸟嘌呤与脱氧戊糖间的糖苷键在中性环境下加热断裂，核苷酸链在G处断裂）酸性（pH=2）下作用G+A肼碱性下作用于T+C加入1mol/L的盐作用于C10/25/202320步骤：①待测序列末端放射性标记（3‘端或5’端）分四份，分别加入中性DMS，稀酸DMS，碱肼，盐环境肼。及一定量的哌啶②电泳。③放射性自显影。④直接读出。10/25/202321***ACTTCGACAA1:ACTTCG2:AACTTCGACTTCGAACTTCGACAACTTCGACAA3:ACACTACTTACTTCACTTCGAC4:ACACTTCACTTCGAC10/25/2023221.4.3自动测定基本原理为双脱氧链终止法采用荧光标记计算机自动读取结果10/25/202323现在多使用不同颜色的荧光剂标记双脱氧核苷酸，然后于一个体系内反应并一起电泳，通过颜色不同读取顺序10/25/2023241.5DNA与蛋白质相互作用的研究1.5.1凝胶滞缓实验（已知DNA片段是否可与特定的蛋白结合）DNA与某种蛋白结合，由于相对分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，从而使迁移率变小1.5.2DNaseⅠ足迹实验（确定结合的位点）用32P标记双链DNA末端，用限制性内切酶去掉其中一个末端，得到只有一条链的单个末端标记的双链DNA，与细胞蛋白提取物混合10/25/202325加入少量DnaseⅠ，消化DNA分子，控制酶的用量，使之达到平均每条DNA只发生一次磷酸二酯键断裂进行凝胶电泳分离若蛋白质不与DNA结合，则将产生一系列仅相差一个核苷酸的DNA若蛋白质与DNA结合，则与蛋白质结合的部分将不产生条带10/25/202326凝胶滞缓实验10/25/20232710/25/2023282基因克隆技术2.1体外基因扩增PCR（聚合酶链式反应，PolymeraseChainReaction）技术、基因体外扩增、无细胞分子克隆10/25/202329原理：双DNA加热变性为单DNA变性单链作为模板加入DNA聚合酶、底物、引物可以合成新的互补链从而达到扩增的目的10/25/202330反应体系与过程①双链DNA②底物、聚合酶③一对与待扩增DNA两端互补的引物过程：预变性变性：双DNA解成单DNA，高温（>91℃）退火：引物同模板结合延伸：合成链循环前三步循环n次，可获得2n个DNA分子*TaqDNA聚合酶是从Thermusaquaticus菌提取的热稳定性酶Taq具有5’-3’DNA聚合酶活性和对双链DNA特异的5’-3’外切核酸酶活性,从细菌体内提出后无3,-5,外切功能,DNA聚合酶中聚合酶1有此校对功能,Taq耐高温动画10/25/2023312.2反向PCR（reversePCR）扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列*先用一种在靶DNA区段上无识别位点的限制性内切酶，切割靶DNA区段两侧的DNA分子*将切割得到的片段连接成环形。*根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对向外引物，保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的未知DNA序列*PCR即可得到靶DNA区段之外的未知DNA序列10/25/20233210/25/2023332.3RACEcDAN末端快速克隆目的:获得全长cDNA（完整的cDNA可通过文库筛选或通过该方法获得，该方法比文库节约时间）一般扩增特异基因或DNA片段需两个特异引物。该方法需已知某一cDNA序列（P163：该序列可来自序列表达标签，减法cDNA库、差示显示和基因文库筛选）流程(P164图)获得RNA（组织提取）去磷酸化（5“端磷酸基团）其他的RNA都可去，but带帽子结构的mRNA受保护去掉帽子结构，加特异RNA寡聚接头(其他的RNA加不上因为去磷酸基团。3’的通过ployA)以特异性寡聚dT（dT3‘端增加一个碱基如：A,T(dT),G,C就只能在特定位置启动DNA合成）为引物，逆转录合成第一条cDNA，包含了寡聚接头的互补序列分别以第一条cDNA为模板进行RACE（5’RACE-----为获得5‘cDNA序列------以5’端寡聚接头的部分序列和3‘基因特异引物进行PCR-----过程见下页图，5’；3’)；10/25/20233410/25/2023352.4CDNA差示分析法筛选特异表达基因1.因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差式分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部分遗传信息能被扩增。2.12/24(实验室多用12/24碱基接头）：每次换接头时12碱基的前4个一样，（与四碱基内切酶的粘性末端互补），后8个与