第3章 基因工程制药 第2节 基因工程药物的分离纯化

第八节基因工程药物的

分离纯化基因工程药物的分离、纯化非常重要。表达的产物都是多肽或蛋白质。它的制得具有以下特点：①表达产物在初始料中含量较低；②含有大量细胞及代谢产物；③表达产物稳定性差，易失活变性；④表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；⑤对其质量要求纯度高、无菌、无热原。一、建立分离纯化工艺的根据⒈含目的产物的起始料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养基的来源及其质量。③生产工艺及条件。⒉物料中杂质的种类和性质。⒊目的产物特性。⒋产品质量的要求二、分离纯化的基本过程

发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离浓缩初步分离高度纯化制剂产品包含体细胞碎片分离变性复性三、分离纯化的技术分离纯化的技术要求：①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。

③收率要高。④两个技数间能直接衔接，不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。⒈细胞破碎与固液分离

⑴细胞收集：离心法、膜分离法。⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。⑶固液分离普通超声破碎仪高压细胞破碎仪⒉目的产物的分离纯化目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。产物特性作用等电点决定离子交换种类及条件相对分子量选择不同孔径的介质疏水性与疏水、反相介质结合的程度生物特异性决定亲和配基溶解性决定分离体系及蛋白浓度稳定性决定工艺采用温度及流程时间产物的特性在分离纯化中的作用分离纯化的方法依赖色谱分离方法

Chromatography概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。色谱分离方法的分类色谱分离方法很多，种类有四、五十种但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，有以下几种：吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱色谱系统的基本组成

色谱分离的基本概念分配系数可由Langmuir方程得出Kd分配系数q、c溶质在固相和液相中的浓度保留时间（tR）和保留体积（VR）反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一阻滞因子Rt阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小洗脱体积色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异色谱柱的理论塔板数、塔板高度反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系理论塔板数的计算方法：N理论塔板数tR保留时间W1/2半峰宽Wb峰底宽度理论塔板高度：L柱长

⑴离子交换层析（ionexchangechromatographyIEC）离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。

常用的离子交换树脂葡聚糖凝胶型DEAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-25，CM-SephadexC-25，SP-SephadexC-25纤维素系列离子交换剂DEAE-SephacelCellex系列琼脂糖系列离子交换剂Sepharose系列SepharoseCL-6B,SepharoseFastFlowBio-GelA系列交联琼脂糖离子交换剂Source系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂S系列阴离子交换树脂Q系列MonoBeads系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列MiniQPC3.2/3:GlutathionesynthetaseSDSStartingmaterialPeak2⑵反相色谱（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色谱（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。原理载体：微粒多孔硅胶（粒径5μm~20μm）HypersilSpherosilXOB075固定相：C18、C8烷基链，C8适于分离蛋白质,C18适于分离核酸,苯基流动相的选择通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。30µm15µm5µmInfluenceofParticleSizeontheSeparationeffect疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。流动相为pH6～8盐水溶液。Me