分析化学 色谱分析法

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色谱分析法概论

chromatography中国药科大学理学院分析化学教研室徐光富

色谱法的发展和分类色谱过程和基本原理基本类型色谱方法及其分离机制色谱法基本理论23高分离效能、高灵敏度、高选择性分析速度快应用范围广色谱法的特点:色谱学的重要作用诺贝尔化学奖：1948年，瑞典Tiselins，电 泳和吸附分析；1952年，英国马丁 (Martin)和辛格(Synge)，分配色谱。应用的科学领域：生命科学、材料科学、环 境科学等。（科学的科学）药学（药物分析）：各国药典收载了许多色 谱分析方法。中国药典二部，700多，纯 度检查、定性鉴别或含量测定。USP，2000+4

第一节色谱法的分类和发展一、色谱法的分类按流动相的分子聚集状态分类: GC、LC、SFC等按固定相的分子聚集状态分类: GSC、GLC、LSC、LLC等按操作形式分类:

柱色谱法、平面色谱法、毛细管电泳法等按色谱过程的分离机制分类:

分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法、毛细管电泳法等56毛细管电色谱法

（CEC）色谱法GSC液相色谱法（LC）柱色谱法平面色谱法毛细管电泳法

（CE）LLCLSCSECIECBPC纸色谱法薄层色谱法

（TLC）LLCLLCLSC气相色谱法（GC）柱色谱法GLC超临界流体色谱法（SFC）二、色谱法的发展

（一）色谱法的历史（二）色谱法的现状和发展趋势

1．新型固定相和检测器的研制

2．色谱新方法的研究

3．色谱联用技术

4．色谱专家系统

7第二节色谱过程和基本原理

一、色谱过程

实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相(stationaryphase)和流动相(mobilephase)。

色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。89色谱过程组分的结构和性质微小差异与固定相作用差随流动相移动的速度不等差速迁移色谱分离。10二、色谱流出曲线和有关概念色谱流出曲线是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。

基线是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。基线反映仪器(主要是检测器)的噪音随时间的变化。色谱峰是流出曲线上的突起部分。正常色谱峰、拖尾峰和前延峰1112对称因子fs

(symmetryfactor)：衡量色谱峰的对称性13到20页到19页定性参数1保留时间(retentiontime;tR)：从进样到某组分 在柱后出现浓度极大时的时间间隔。死时间(t0)：分配系数为零的组分，即不被固 定相吸附或溶解的组分的保留时间。

调整保留时间

()：某组分由于溶解（或被吸附）于固定相，比不溶解（或不被吸附） 的组分在柱中多停留的时间。

14定性参数2

保留体积(VR)：从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体积。

15死体积(V0)：由进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔容积的总和。定性参数3调整保留体积(adjustedretention volume;)：由保留体积扣除死体积 后的体积16相对保留值(r)

：两组分的调整保留值之比定量参数峰高(peakheight；h)：组分在柱后出现浓度 极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的 距离。峰面积(peakarea；A)：色谱曲线与基线间 包围的面积。

17返回柱效参数标准差(standarddeviation；σ)：正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。σ的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。σ越大，组分越分散；反之越集中。半峰宽

(W1/2)：峰高一半处的峰宽。

W1/2=2.355σ

峰宽

(peakwidth；W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。

W=4σ

或W=1.699W1/2

18返回总分离效能指标分离度(resolution；Rs)：又称分辨率。是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。19分离度设正常峰，W1≈W2=4σ

，则R=1.5时，99.7%面积(tR

±3σ)被分开，∆

tR=6σ

，称6σ分离，即基线分离。20三、分配系数与色谱分离(一)分配系数和保留因子

分配系数

(distributioncoefficient；K)是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相(s)与流动相(m)中的浓度(C)之比。21分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。是组分的特征常数。分配系数与色谱分离保留因子(capacityfactor；k)：在一定温度和压力 下，达到分配平衡时，组分在固定相和流 动相中的质量(m)之比。又称为质量分配系数或分配比。22还与固定相和流动相的体积有关。保留因子与分配系数的关系分配系数与色谱分离（二）分配系数和保留因子与保留时间的关系23tR=t0(1+k)tR=t0(1+K)v=L/tRu=L/t0（三）色谱分离的前提KA≠KB

或kA≠kB

是色谱分离的前提。24=t0(1+KA)=t0(1+KB)

tR=t0(KA－KB)

tR≠0KA≠KBkA≠kB分配系数与色谱分离推导过程：第三节基本类型色谱方法及其分离机制分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法空间排阻色谱法25一、分配色谱法26分配色谱法分离原理

利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。27溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。在LLC中K主要与流动相的性质(种类与极性)有关；在GLC中K与固定相极性和柱温有关。分配色谱法固定相又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。流动相气液分配色谱法：气体，常为氢气或氮气。液液分配色谱法：与固定相不相溶的液体。

正相液液分配色谱：流动相的极性弱于固定相的极性。反相液液分配色谱：流动相的极性强于固定相的极性。

28分配色谱法洗脱顺序由组分在固定相或流动相中溶解 度的相对大小而决定。29正相液液分配色谱：极性强的组分后被洗脱。 （库仑力和氢键力）反相液液分配色谱：极性强的组分先出柱。二、吸附色谱法分离原理

利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。吸附过程是试样中组分的分子(X)与流动相分子(Y)争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。303132吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。吸附色谱法固定相多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。硅胶表面硅醇基为吸附中心。经典液相柱色谱和薄层色谱：一般硅胶高效液相色谱：球型或无定型全多孔硅 胶和堆积硅珠。气相色谱：高分子多孔微球等33吸附色谱法流动相有机溶剂（硅胶为吸附剂）洗脱能力：主要由其极性决定。强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。Snyder溶剂强度

o：吸附自由能，表示洗脱能力。

o值越大，固定相对溶剂的吸附能力越强，即洗脱能力越强。3435表17-1一些溶剂在硅胶上的

o值溶剂

溶剂强度（

o）溶剂

溶剂强度（

o）正戊烷0.00甲基特丁基醚0.48正己烷0.00醋酸乙酯0.48氯仿0.26乙腈0.52二氯甲烷0.40异丙醇0.60乙醚0.43甲醇0.70吸附色谱法洗脱顺序

ka=KaSa/Vm在色谱柱（Sa与Vm一定）时，Ka大的组分保留强，后被洗脱，Ka小的组分在吸附剂上保留弱，先被洗脱。Ka与组分的性质（极性、取代基的类型和数目、构型有关）。3637以硅胶为吸附剂：极性强的组分吸附力强。①饱和碳氢化合物为非极性化合物，不被吸附。②基本母核相同，引入的取代基极性越强，则分子的极性越强，吸附能力越强；极性基团越多，分子极性越强(但要考虑其他因素的影响)。③不饱和化合物的吸附力强，双键数越多，吸附力越强。④分子中取代基的空间排列三、离子交换色谱法分离原理利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。阳离子交换：阴离子交换：离子交换通式：38交换再生++3RNR+OH-ClRNR+3ClOH交换再生++RSOH+Na+Na++33HRSO四、空间排阻色谱法分离原理

根据被分离组分分子的线团尺寸 进行分离。 也称为分子排阻色谱法。3940空间排阻色谱法

根据空间排阻（stericexclusion）理论，孔内外同等大小的溶质分子处于扩散平衡状态：渗透系数：

Kp=

Xs

/

Xm

（0＜Kp＜1

）由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙的大小所决定。在一定分子线团尺寸范围内，Kp与分子量相关，即组分按分子量的大小分离。41空间排阻色谱法固定相多孔凝胶：软质、半软质和硬质主要性能参数平均孔径排斥极限（Kp=0）：不能渗透进入凝胶的任何孔隙最低分子量分子量范围：排斥极限（Kp=0）与全渗透点（Kp=1）之间的分子量范围围。选择凝胶时应使试样的分子量落入此范围。42空间排阻色谱法流动相

要求：能溶解试样、润湿凝胶，粘度要低水溶性试样选择水溶液为流动相(称为凝胶过滤色谱gelfiltrationchromatography；

GFC)；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相(凝胶渗透色谱gelpermeationchromatography；GPC)。43空间排阻色谱法保留体积与渗透系数的关系44Vm≈V0分子线团尺寸（分子量）大的组分，其渗透系数小，保留体积也小，因而先被洗脱出柱。小结色谱过程方程式：分配系数大的组分保留时间长（保留体积大），晚流出色谱柱。K在分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和凝胶色谱中，分别为狭义分配系数K、吸附系数Ka、选择性系数KA/B和渗透系数Kp，Vs分别为色谱柱（或薄层板）内固定液体积、吸附剂表面积、离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。45第四节色谱法基本理论4647要使R大，必须：

1、∆tR大---∆k大----热力学

2、W小---峰展宽小---动力学48色谱理论包括两方面:热力学理论：研究分配(分离)过程，塔板理论（platetheory）。动力学理论：研究各种动力学因素对峰展宽的影响，速率理论（ratetheory）。一、塔板理论

始于马丁（Martin）和辛格（Synge）提出的塔板模型。分馏塔：在塔板上多次气液平衡，按沸点不同而分离。色谱柱：组分在两相间的多次分配平衡，按分配系数不同而分离。49塔板理论假定：①在色谱柱内每一“塔板”H内，组分在两相间瞬间达到分配平衡。②流动相间歇式进入色谱柱，每次进入一个塔板体积。③分配系数在各塔板内是常数。④纵向扩散可以忽略。50一根色谱柱n=103以上，组分有微小的分配系数(容量因子)差别即可实现完全分离。 分配系数(容量因子)不等是分离的前提。5163速率理论

(一)影响H的动力学因数涡流扩散原因：柱填充不均匀A=2

dp64A：涡流扩散系数，其单位为cm。

：填充不规则因子，填充技术和填料颗粒形 状决定。dp：填料(固定相)颗粒的平均直径，

dp小，A小；但dp

太小，

和柱阻大。速率理论

(一)影响H的动力学因数纵向扩散(l