第一章 分离方法

1第三节提取分离方法

天然药物化学成分复杂，在研究和应用其所含的有效成分时，必须将它们从药材中提取、分离出来，这是研究天然药物化学成分的重要步骤。2一般来说，中药的提取是指从原药材中将化学成分提出的过程。所得的提取物中，通常仍包含多种性质相似的化合物。分离是指把提取物中所含的各种成分一一分开，最后把得到的单体加以精制的过程。3在进行提取前，应对所用材料的基源、产地、药用部位、采集时间与方法等进行考察，并系统查阅文献，以充分了解前人的经验。中药材料在提取前应进行适当的预处理，如粉碎、酸化等。4目标物为已知成分或已知化学结构类型——工业化生产方法目标物为未知有效成分或有效部位

系统溶剂分离法活性跟踪分离法5按提取原理分类：

（一）溶剂提取法（二）水蒸气蒸馏法（三）升华法

溶剂法最为常用。一、中草药有效成分的提取6

1．溶剂提取法的原理：相似相溶

理想溶剂：有效成分溶解性大，无效成分溶解性小，与植物成分不起化学反应；安全、成本低；（一）溶剂提取法7

溶剂分类①水

②亲水性有机溶剂：

如甲醇、乙醇、丙酮③亲脂性有机溶剂：

石油醚、饱和烷烃、氯仿、苯、乙酸乙酯注意：共存物的影响糖苷，氨基酸萜类、甾体类、芳香类8溶剂极性大小水、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、苯、石油醚、环己烷极性：大——小亲脂性：小——大亲水性：大——小92、溶剂法分类（1）浸渍法：药材+溶剂浸泡提取物（2）渗漉法：药材粉碎后，加入渗漉桶中（3）煎煮法（4）回流提取法（5）连续回流提取法冷提热提（6）超临界流体萃取技术（7）超声波提取技术（8）微波提取法10（1）浸渍法：室温、稀乙醇适用：遇热不稳定，含大量淀粉、树胶、果胶、粘液质的中药缺点：时间长，效率不高；出膏率低；溶剂用量大；用水为溶剂时，提取液易于发霉11(2)渗漉法：室温、稀乙醇

不断向粉碎的中药材添加新鲜的浸出溶剂缺点:消耗溶剂量大、费时长、操作比较麻烦12（3）煎煮法：水简便缺点：含挥发性成分或有效成分遇热易分解的中药材不适用13（4）回流提取法：有机溶剂用易挥发的有机溶剂加热回流提取缺点：热不稳定的不能用，溶剂消耗量大，操作麻烦

避免有机溶剂的挥发，一般提取三次14（5）连续回流提取法常用索氏提取器完成，弥补了回流提取法中溶剂消耗量大，操作太烦琐的不足时间长，不适应受热分解的成分15药材16（6）超临界流体萃取技术

物质处于其临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上状态时，成为单一相态，将此单一相态称为超临界流体（SF）。超临界流体特点:兼有气、液两重性，即密度接近于液体，而粘度和扩散系数又与气体相似，因而它不仅具有与液体溶剂相当的萃取能力，而且具有优良的传质效果。

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在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，通过控制不同的温度、压力以及不同种类及含量的夹带剂，使超临界流体有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。称为超临界流体萃取技术。原理：18临界温度低(Tc=31.3℃)临界压力小(Pc=7.15MPa)无色、无味、无毒、不易燃、化学惰性、低膨胀性、价廉、易制得高纯气体等特点，现在应用最为广泛。

可作为SCF的物质：

二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、甲醇、氨和水等二氧化碳：19◆超临界流体萃取技术的优点：

1）操作范围广，便于调节；2）选择性好；3）萃取、分离一步完成；4）溶剂回收简便，且可循环使用；5）萃取效率高，速度快；6）低温操作，特别适合于热敏性组分；7）可以调节萃取物的粒度；8）无有机溶剂残留。20局限性1、对脂溶性成分溶解能力强，而对水溶性成分溶解能力弱2、设备造价高3、难清洗21（7）超声波提取技术

采用超声波辅助提取溶剂进行提取的方法。超声波为弹性震动波。可造成植物细胞壁及整个生物体的瞬间破裂，使溶液能渗透到药材的细胞中。优点：不改变有效成分的结构；缩短提取时间、提高提取率。22(8)微波提取法原理：分子对微波具有选择性吸收，极性分子可吸收微波能，然后弛豫，以热能形式释放能量，使介质内部温度迅速上升，造成内部压力过大，导致成分流出溶解于溶剂中；

微波所产生的电磁场可使部分成分向萃取溶剂界面扩散，加速其热运动，缩短提取时间，提高效率，降低了提取温度。23（二）水蒸气蒸馏法

适用于具有挥发性的、能随水蒸气蒸馏而不被破坏、且难溶或不溶于水的成分的提取。沸点多在100°以上，并在100°左右有一定的蒸汽压原理：两种互不相溶的液体共存时，各组分的蒸气压和它们在纯粹状态时的蒸气压相等，而另一种液体的存在并不影响它的蒸气压，混和体系的总蒸气压等于两纯组分蒸气压之和。挥发油多用此法2425

固体物质受热时不经过熔融直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结为固体的现象如樟木中樟脑的提取，茶叶中的咖啡因等（三）升华法26二、中草药有效成分的分离与精制

（一）根据物质溶解度差异进行分离（二）根据化合物在两相溶剂间分配比不同进行分离（三）根据物质的吸附性差别进行分离（四）根据物质分子大小差别进行分离（五）根据物质离解程度不同进行分离27（一）根据物质溶解度差别1、结晶与重结晶：利用温度不同，溶解度改变分离。待纯化物A+杂质B、C加MeOH热溶热滤残渣（C）滤液（A+B）冷置析晶母液（B）结晶（A）合适溶剂：对有效成分与杂质在冷热情况下溶解度显著差异。28

水/醇法：水提液+醇（数倍）：多糖、蛋白质除去。醇/水法：醇提液+水（数倍）：叶绿素、树脂除去。醇/醚法（醇/丙酮法）：纯化皂苷

加另一种极性相差较大的溶剂——混合溶剂极性改变——部分物质沉淀析出2、改变混合溶剂极性29例子：水/醇法中药水提取液加数倍量浓醇静置过夜母液（目标成分）沉淀（水溶性杂质）（如蛋白质、多糖、果胶、粘液质）303、改变pH值酸、碱、两性成分调节PH——改变分子存在状态——改变溶解度A．酸/碱法（酸提取碱沉淀法）：生物碱的提取、纯化B．碱/酸法（碱提取酸沉淀法）：黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化C.调节PH至等电点，沉淀蛋白A．酸/碱法（酸提取碱沉淀法）

——生物碱的提取、纯化H+BH+BOH-醇提物浸膏（B）药渣酸水提取液稀酸水提取（BH+

）碱化沉淀（B）碱水液（水溶性杂质）（脂溶性杂质）药材（HA）药渣碱水提取液碱水提取（A-

）酸化沉淀（HA）酸水液（水溶性杂质）（脂溶性杂质）B．碱/酸法（碱提取酸沉淀法）

——黄酮、蒽醌等酚性成分的提取、纯化H+A-HAOH-334、金属盐络合法：

酸、碱成分——加入某种沉淀试剂——水不溶性盐A．酸性成分Pb2+、Ba2+

、Ca2+

水悬浮，通H2S

母液（

）B.碱性化合物苦味酸/苦酮酸，磷钼酸/磷钨酸/镭氏盐

强H+

，Et2O萃取H2O层（

）

34（二）根据化合物在两相溶剂中的分配比不同进行分离

液-液萃取法逆流分溶法（CCD）液滴逆流色谱法（DCCC）高速逆流色谱法（HSCCC）气液分配色谱法（GC或GLC）液-液分配色谱法（LC或LLC）351、液液萃取与分配系数K值

K=CU/CL液液萃取的基本原理

在一定温度和压力下为常数。上层下层362、分离难易与分离因子β≥100，简单萃取100>β≥10，须萃取10-12次β≤2时，100以上萃取才能完成β≌1时，无法分离β=KA/KB（KA>KB），表示分离难易373、分配比与PH

对于酸、碱及两性化合物，pH改变可使存在状态改变,影响分配比。HA+H2OA-+H3O+Ka=[A-][H3O+]/[HA]pH=pKa+lg([A-]/[HA])38若使酸性物质完全离解，pH=pKa+lg([A-]/[HA])≌pKa+lg（100/1）故pH≌pKa+2使酸性物质完全游离，即A-均转变为HA,则

pH≌pKa-239

酚类pka一般为9.2-10.8pH<7游离型,pH>12解离型羧酸类pKa一般为5pH<3游离型,pH>7解离型

40碱性化合物与此相反:

pH>12主要为游离型

pH<3主要为解离型

故在不同pH的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配，可以将酸性、碱性、中性及两性化合物分离开来。414、逆流分溶法（CCD法，Countercurrentdistribution）：

分离因子较小时

是一种多次连续的液-液萃取分离过程。42特点：

多次转移，萃取效果好；条件温和，样品易回收；适合中等极性、不稳定成分的分离。

不足：样品极性过大过小，K受浓度或温度影响过大，易乳化溶剂系统不宜。

435、DCCC(液滴逆流色谱)和HSCCC(高速逆流色谱法)

是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使流动相呈液滴形式在固定相间交换，分离效果好。多用于分离皂苷、生物碱、蛋白质、糖类等等。446、液-液分配柱色谱：

将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充于色谱柱中，用流动相洗柱。物质在两相溶剂中相对作逆流移动，在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。45（1）正相色谱载体：硅胶（硅胶吸水＞17％，不作吸附剂，而作为载体）硅藻土、纤维素粉固定相：强极性溶剂，如水、缓冲液等流动相：氯仿、乙酸乙酯等弱极性有机溶剂分离：极性较大的成分洗脱规律：极性小成分先洗下极性大成分后洗下46（2）反相色谱固定相：可用石蜡油反相硅胶RP-18、RP-8、RP-2流动相：则用水或甲醇等强极性溶剂分离：脂溶性化合物洗脱规律：极性大成分先洗下极性小成分后洗下47（3）加压液相柱色谱快速色谱低压液相色谱中压液相色谱高压液相色谱48

物理吸附：无选择性，吸附与解吸可逆，如硅胶、氧化铝吸附活性炭化学吸附：有选择性，吸附牢固

半化学吸附：介于上述二者之间，如聚酰胺的氢键吸附（三）根据物质吸附力差别进行分离491、物理吸附基本规律基本规律：相似者易于吸附吸附三要素：吸附剂、溶质、溶剂。吸附剂A物质分子B物质分子溶剂分子固定相（吸附剂）流动相（溶剂）50极性吸附剂：硅胶、氧化铝①对极性物质的亲和力强于弱极性物质。②溶剂极性弱，吸附剂对溶质吸附力强，溶剂极性增强，吸附剂对溶质吸附力弱。③溶质被硅胶、氧化铝吸附，当加入极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来。5152非极性吸附剂：活性炭与硅胶、氧化铝相反对非极性物质具有较强的亲和能力溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力也降低溶剂的洗脱能力随溶剂极性的降低而增强532、极性及其强弱判断

极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素表示分子中电荷不对称程度与偶极矩、极化度及介电常数有关54(1)官能团极性RCOOH>Ar-OH>H2O>R-OH

>R-NH2>RCONH2>RCHO>RCOOR’>R-OR’>R-X>R-H

55(2)化合物的极性由分子中所含官能团的种类、数目及排列方式等综合因素决定CH３—(CH2)16—COOH56

对于骨架相同的化合物，根据所含取代基的极性判断分子的极性强弱。骨架相同，取代基数目和种类不同，如果数目相差不大，含有极性最大的化合物的极性最强。

>极性57骨架不同，取代基数目相差较大时，要具体情况具体分析。CH3(CH2)16COOH>极性58黄花夹竹桃果仁中的强心苷名称RR’R”黄夹苷ACHO(D-Glc)2H黄夹苷BCH3(D-Glc)2H黄夹次苷ACHOHH黄夹次苷BCH3HH黄夹次苷CCH2OHHH黄夹次苷DCOOHHH单乙酰黄夹次苷BCH3HCOCH3123456759（3）溶剂的极性ε介电常数越大，极性越强乙烷〈苯〈乙醚〈氯仿〈乙酸乙酯〈乙醇〈甲醇〈水604、聚酰胺吸附色谱法半化学吸附氢键吸附极性物质与非极性物质均可适用适合酚类、醌类、黄酮类化合物61聚酰胺的性质及吸附原理性质：为高分子聚合物，不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、酮等，对碱稳定；溶于浓盐酸、冰酸、甲酸。

62（1）形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。

吸附能力：63（2）成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。64（3）分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。65(4)芳香苷元＞相应苷；单糖苷＞双糖苷＞叁糖苷66影响因素-溶剂的影响

吸附环境：水或低浓度醇中。洗脱能力由弱至强：

水→甲醇→丙酮→氢氧化钠水溶液→甲酰胺→二甲基甲酰胺→尿素水溶液

67聚酰胺色谱的应用

适用于酚类、黄酮、醌类对生物碱、萜类、甾体、糖类、氨基酸等也有广泛的用途用于脱鞣质薄层色谱和柱色谱两种形式。68判断下列化合物在硅胶吸附色谱和聚酰胺色谱柱的色谱行为：695、大孔吸附树脂

高分子吸附材料白色球形颗粒非极性和极性两种理化性质稳定70（1）大孔吸附树脂的吸附原理以苯乙烯、ɑ-甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、丙腈等为原料加入一定量致孔剂甲酰胺聚合而成吸附性（范德华力及氢键）与分子筛性（多孔结构）结合。71（2）影响吸附的因素1）吸附剂的表面性质：如比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键2）被吸附的化合物结构的影响：

A、非极性化合物在水中易被非极性大孔树脂吸附；极性化合物在水中易被极性大孔树脂吸附。B、物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小；反之就大。C、能与大孔吸附树脂形成氢键的化合物易被吸附。

723）洗脱剂的影响：

极性越小，洗脱能力越强一般先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增高的乙醇、甲醇洗脱多糖、蛋白质、鞣质等水溶性杂质会随着水流出、极性小的物质后洗出73（3）大孔吸附树脂在中药研究中的应用应用：广泛用于天然化合物的分离和富集工作

—苷与糖的分离，苷类、生物碱的富集，黄酮类、三萜类化合物的分离等。74（四）根据物质分子大小差别

进行分离

透析法凝胶过滤法超滤法超速离心法751、凝胶过滤法（凝胶渗透色谱、分子筛滤过、排阻色谱等）（1）分离物质的原理：分子筛，按分子由大到小顺序出柱76（2）凝胶的种类与性质葡聚糖凝胶（SephadexG）

—只适于在水中应用

—不同规格适合分离不同分子量的物质羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）

—可在水及有机溶剂中使用。

—在由极性及非极性溶剂组成的混合溶剂中常起到反相色谱的作用。77（五）根据物质离解程度不同进行分离

离子交换法电泳技术781、离子交换法分离物质的原理以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱流动相经过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，具有可交换的离子则从树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件，用适当溶剂从柱上洗脱下来。792、离子交换树脂的结构及性质母核部分离子交换基团

阳离子交换树脂

-强酸性(-SO3-H+)、弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂

-强碱性（-N+(CH3)3Cl-）、弱碱性（-NH2,-NH-,-N-）阴离子交换阳离子交换80小结1、中草药成份提取方法

溶剂法：各自的适应范围及优缺点

-浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法

水蒸气蒸馏法：对物质的性质要求升华法812、中草药成份分离方法

根据物质溶解度差异进行分离：-结晶法、水/醇法、醇/水法、酸/碱法、碱/酸法等各自适应分离什么类型的化合物根据化合物在两相溶剂间分配比不同进行分离

-液液萃取法原理、正相色谱和反相色谱根据物质的吸附性差别进行分离

-硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、大孔吸附树脂的吸附规律、原理根据物质分子大小差别进行分离

-分子筛的原理根据物质离解程度不同进行分离-离子交换树脂的原理82第四节结构研究法83一、化合物的纯度测定

物理常数：mp，晶形、色泽是否均一各种色谱方法

1）TLC（PC）：三种展开系统均为单一斑点。

2）GC，HPLC84二、结构研究中采用的主要方法质谱红外光谱紫外-可见吸收光谱核磁共振谱85（一）质谱（MS）质谱常用于确定分子量，并可求算分子式和提供其它结构信息。在一定条件下化合物的开裂遵循一定规律86电子轰击法（EI-MS）应用最普遍的含有丰富的碎片离子信息缺点：容易分解的化合物或难以气化的化合物，测不到分子离子峰,只有碎片峰；大分子物质难以气化而无法测定87软电离法

化学电离质谱（CI）场解析电离质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FA