第三章-动物细胞制药

生物技术制药第三章动物细胞制药第五章动物细胞制药第一节概述第二节动物细胞的形态和生理特点第三节生产用动物细胞的要求和获得第四节动物细胞的培养条件和培养基第五节动物细胞培养的基本方法第六节动物细胞大量培养的方法和操作方式第七节动物细胞生物反应器第八节动物细胞产品的纯化方法和质量要求第九节动物细胞产品的制造实例第十节动物细胞制药的前景和展望第一节概述（1）发现细胞和细胞学说创立。1665年英国物理学家Hooke通过自制的显微镜观察切成薄片的软木时看到死细胞的细胞壁。（2）组织培养或细胞培养。1885年德国生理盐水培养鸡胚组织，至1907年，细胞体外培养宣布进入一个新时代。（3）细胞工程学时代。运用现代生物科学的理论、方法和技术，按照人们预先设计的蓝图，有计划大规模地培养细胞和组织以获得生物产品，或改变细胞遗传物质的组成以获得新的生物或其产品。以及发展这些技术的研究领域。（3）细胞工程学时代包括真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术，细胞融合的理论和技术，细胞器特别是细胞核移植的理论和技术，染色体改造的理论和技术，转基因动、植物的理论和技术，细胞大量培养的理论和技术，以及产物分离纯化的理论和技术。（4）细胞工程制药成为现代制药技术中常用的手段。细胞是生物体的结构单位和功能单位。细胞工程是利用细胞的全能性，采用组织与细胞培养技术对动、植物进行修饰，为人类提供优良品种和保存濒危珍稀物种。细胞工程主要包括体细胞融合、核移植、细胞器摄取和染色体片段重组等。体细胞融合是指两个不同种类的细胞，加上融合剂，在一定条件下，彼此融合成杂交细胞，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，从而打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重要的意义。克隆技术便是细胞核移植的一个最为典型的应用。细胞器的摄取主要是指叶绿体和线粒体的摄取。如用白化型原生质体摄取正常的叶绿体，进而发育成正常的绿色植物；用抗药型草履虫的线粒体植入其他草履虫细胞，使后者获得抗药性。染色体片段重组是利用染色体替换来改变生物遗传特性，如利用染色体的易位、缺体等方法，获得新的染色体组合第二节动物细胞的形态和特点一、动物细胞的形态二、动物细胞的生理特点三、动物细胞生长的特点一、动物细胞的形态细胞的分化（或特化）形态分化在离体培养同样也存在。离体培养的细胞分为两类：贴壁依赖型（anchorage-dependent）和非贴壁依赖型（anchorage-independent），前者可简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。动物细胞结构图一、动物细胞的形态1、贴壁细胞这类细胞的生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长、增殖。细胞在该表面生长一般形成两种形态，即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。1.细胞种类：人肝肿瘤细胞

2.培养的天数：复苏后12小时；

3.放大倍速：倒置显微镜X10；

4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清（杭州四季青)；

5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长

一、动物细胞的形态2、悬浮细胞这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液的淋巴细胞和用以生产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。Bme细胞

1.细胞种类：家蚕胚胎细胞

2.培养的天数：传代后3d

3.放大倍速：倒置显微镜放大倍数：X10、X25

4.培养基种类：Grace+10%胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述:细胞悬浮生长，呈梭形，生长速度快，2d～3d又可传代

3、兼性贴壁细胞兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。CHO细胞

1.细胞种类：仓鼠卵巢细胞；

2.培养的天数：2天；

3.放大倍速：倒置显微镜X10；

4.培养基种类：DMEM+10%胎牛血清；

5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭型贴壁生长

二、动物细胞的生理特点1、细胞的分裂周期长一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期S

期：DNA的合成，一般为6~8小时G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为2~5h。M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。二、动物细胞的生理特点2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需要一定的基质（如玻璃，塑料等）上贴附，伸展后才能生长增殖，其机制可能与电荷、钙镁离子的作用以及许多贴附因子有关。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞才停止增殖。保持一定的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加，该现象就称为接触抑制或密度依赖抑制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生长，细胞密度可大大增加。二、动物细胞的生理特点3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的当细胞培养开始，称之为原代培养，也叫初始培养，指直接由机体取得材料（细胞、组织或器官），到第一次传代前的培养即为原代培养，经过传代后，即成为有限细胞系，即有限的生长传代时间，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。但是若向培养基中加入表皮生长因子，可使上皮细胞的寿命从原来的50代增加至150代。当细胞突变为异倍体后，该细胞可转变成无限细胞系，或称连续细胞系。二、动物细胞的生理特点4、动物细胞对周围环境比较敏感无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。5、动物细胞培养基的要求高与细菌和植物细胞不同，其需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳原的葡萄糖以及多种细胞生长因子和贴附因子，而且不同种类要求又有变化。二、动物细胞的生理特点6、动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同场所：游离的核糖体以及粗面内质网上的核糖体，前者合成的蛋白质都用于细胞质基质内，后者上合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖。糖基化与细胞的许多生理功能密切相关。综上，采用动物细胞作为宿主细胞生产药品有利有弊。三、动物细胞生长的特点细胞生长：（1）单细胞生长：细胞周期细胞周期定义：细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的一个完整的过程称为一个细胞周期（CellCycle），细胞周期包括间期和细胞分裂期。间期是细胞代谢，DNA复制的时期，它由一个DNA合成期（S期）和S期前后的两个间隔期G1和G2组成，细胞分裂期（M）包括有丝分裂期和胞质分裂期两个主要过程。

细胞周期(2)群体细胞生长：生长曲线

N2=N1·2g（N2=t2时的细胞数，N1=t1时的细胞数，

g=t1－t2时间内细胞繁殖的代数）

(d)logN(cell/ml)延迟期对数生长期稳定期衰亡期

细胞生长曲线（1）

潜伏期（Latentphare）：新接种的细胞在培养液中经过一段悬浮状态，贴附于培养器皿表面，各种细胞贴附速度不同，这与细胞种类、培养基成分，底物性质等条件有关。初代培养细胞贴壁较慢，大约10~24小时，连续细胞系和恶性细胞系贴壁较快，30min内即可完成。贴壁后，细胞并不马上分裂，仍需一个潜伏期。潜伏期的长短与细胞接种量细胞种类培养基性质（pH值，组成）细胞接种时的状态（对数期接种，非对数期接种）

有关（2）

对数生长期（logarithmicgrowthphase）经过潜伏期的适应与准备，培养细胞进入细胞一代最具活力时期——对数生长期。在这个时期，细胞分裂旺盛，细胞分裂相增多，分裂相的数量标志着细胞分裂的旺盛程度，以分裂指数（MI）表示。细胞有丝分裂指数（mitoticindex，MI）MI=（分裂相个数/1000个细胞）×100%初代细胞的MI低，连续细胞系和肿瘤细胞系MI高达30~5%，一般细胞MI介于0.1%~0.5%之间。此时细胞群体数与细胞增长速率成正比例函数。对数生长期一般可达3~5天。在一个理想的物理化学环境下，如适宜的温度、pH值、溶氧量、合适的混合强度以及适宜的营养配比，可控制的有害物浓度，培养细胞就会处于一种较恒定的生长分裂状态。（3）

稳定期（stationaryphase）对数生长期细胞增殖到一定数量，在培养空间和营养物质有限，代谢产物积累的不利条件下，细胞生长进入一个新分裂的细胞数与死亡的细胞数相等的动态平衡阶段，细胞总数不再增加，但细胞代谢活动仍在进行中。（4）

衰亡期（senescencephase）由于营养物质的耗尽和有害物质的作用，培养细胞进入死亡细胞数多于分裂细胞数的衰亡阶段，活细胞数减少，死细胞数增多。一些正常细胞生命周期是有限的，分裂次数也有限，50~60次，或50~60代左右，如将20~30代的细胞进行保存一定时间后，复苏培养，细胞仍只可传20~30代左右，最后衰老死亡。对一些肿瘤细胞或转化细胞（tansformedcell）[由于物理因子（UV、X），在含因子或病毒感染等造成]，可以获得能够无限生长繁殖的连续细胞系（cellline），它们没有最多分裂次数限制而成为“永生细胞”（immortalcell）。2．贴壁生长过程：接种后细胞生长过程可分为四个阶段（以贴壁细胞为例）：（1）

游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态，由于胞质回缩，胞体变圆。（2）

吸附期：细胞类型不同，贴壁时间有所差异。单个细胞、传代细胞较快、组织块，较大细胞团较慢，一般细胞可在24小时内贴壁，平均贴壁时间5~20min，状态不好的细胞及濒死细胞，培养基偏酸、偏碱，培养瓶不洁等不利于细胞贴壁。（3）

繁殖期：圆形悬浮细胞贴壁后延展，虽有细胞运动，但无分裂，经一段停滞，开始生长分裂，随着细胞数量增多，同时有一定的移动现象，细胞间开始接触并连接成片，这时细胞的运动便会停止，这种由于细胞间的接触而发生的抑制现象，称为接触抑制（contactinhibition），接触抑制只是抑制细胞运动，并不抑制细胞分裂。所以当细胞连接成片后，仍能继续分裂，直到细胞达到一定密度，才停止分裂，叫密度抑制（densityinhibition），能抑制细胞分裂。但肿瘤细胞及转化细胞不存在密度抑制，可以罗叠生长。（4）

退化期：当细胞长满瓶底后，如不及时传代，由于营养物消耗和代谢物积累，细胞进入退化期，此时细胞轮廊增强，细胞内堆积有颗粒物，为膨胀的线粒体，细胞变得粗糙，严重时细胞从瓶壁脱落，引起死亡（长老了），所以应及时传代。第三节生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求二、生产动物细胞的获得三、常用生产用动物细胞的特性四、基因工程细胞的构建和筛选五、细胞库的筛选一、生产用动物细胞的要求（1）原代正常组织分离的细胞（2）二倍体细胞，传代细胞（3）传代细胞用于生产（4）按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中DNA残留量。二、生产动物细胞的获得原代细胞、已建立的二倍体细胞系、可无限期传代的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞系。1、原代细胞：是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的细胞悬液。一般1g组织约有109个细胞。2、二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。3、转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。4、融合细胞系在诱导物的作用下，细胞膜会发生一定的变化，从而导致两个或多个细胞的融合。常用的诱导物为仙台病毒和聚乙二醇。物理的方法有高压电场等。5、重组工程细胞系三、常用生产用动物细胞的特性（1）WI-38：1961年来源于女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用BME（Eagle’sbasalmedium）加小牛血清，pH控制在7.2，同工酶为G6PDB型。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50代，上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。（2）MRC-5：特性和用途与WI-38相似，1966年来源于14周正常男性，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。三、常用生产用动物细胞的特性（3）CHO-K1：1957年从中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨酸。核型为2n=20~22。目前广泛用于构建工程细胞的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株CHO-dhfr-，它常用的培养基为DMEM培养基，加0.1mol/L次黄嘌呤和0.01mmol/L胸苷，以及10%小牛血清。三、常用生产用动物细胞的特性（4）BHK-21：1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经13次的克隆的细胞。成纤维细胞，2n=44。通常用的培养基为DMEM培养基，添加7%胎牛血清。过去多用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病疫苗，现在已被用于构建工程细胞。三、常用生产用动物细胞的特性（5）Vero：1962年来源于正常的成年非洲绿猴肾。是贴壁依赖的成纤维细胞，2n=60，高倍体率为1.7%，可持续地进行培养。通常用的培养基为199培养基，添加5%胎牛血清。该细胞可支持多种病毒的增殖，包括脊髓灰质炎、狂犬病病毒，已被批准用于人体。（6）Namalwa：1972年来源于肯尼亚患有Burkitt淋巴瘤的病人体中，后在瑞典构建的一株人的类淋巴母细胞，该细胞有2.8%的高倍体率，多数细胞有12~14条标记染色体，单条X染色体，无Y染色体。通常用的培养基为RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于大规模生产-干扰素。三、常用生产用动物细胞的特性（7）SP2/0-Ag14：该细胞是1978年中通过融合的方法，从有抗羊红细胞活性的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系P3X63Ag8融合的杂交瘤SP2/HL-Ag亚克隆中分离得到。它不分泌任何免疫球蛋白抗体链，能耐受8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine）20g/ml，但在含HAT选择培养基中不能存活。通常用的培养基为DMEM培养基，添加10%胎牛血清。该细胞系已被广泛地用于单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗体的生产。近年来正在被开发为生产其他药品的高表达宿主三、常用生产用动物细胞的特性（8）Sf-9：1983年从亲代IPLB-SF21AE中克隆形成。亲代细胞则在1977年从秋粘虫（Spodopterafrugiperda)的蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蠖核型多角体病毒（AutographacaliforniaMNPV）和其他杆状病毒（Baculovirus）高度敏感。通常用的培养基为Grace培养基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液，以及10%胎牛血清。目前已经被广泛用于高效表达外来蛋白制品。四、基因工程细胞的构建和筛选原代细胞、二倍体细胞系和转化细胞系三者在生产中都有使用，但在生产中采用更多的、更有前景的是融合细胞及采用基因工程手段构建的各种工程细胞。当前被用以构建工程细胞的动物细胞有CHO-dhfr-、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0和Sf-9等细胞。那么如何获得动物工程细胞呢？四、基因工程细胞的构建和筛选1、真核细胞基因表达载体的构建2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选1、真核细胞基因表达载体的构建目前一般使用的载体有两类：一是病毒载体，如牛痘病毒、腺病毒和逆转录病毒和杆状病毒等。牛痘病毒已被广泛地用来构建成多价疫苗，腺病毒和逆转录病毒载体正被试用用于基因治疗中，而杆状病毒载体-昆虫细胞系统已被成功地用于300多种外源基因的高效表达。用杆状病毒做载体有许多优点：（1）该病毒基因组是双链DNA，容易进行重组；（2）插入7~8kb的DNA不影响正常病毒粒子的形成；（3）多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系，因此用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；（4）多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20~30%；（5）用光学显微镜可看到多角体，容易以此为标记物来挑选阳性克隆；（6）如果用家蚕杆状病毒，还可在蚕体直接表达外源基因。1、真核细胞基因表达载体的构建1、真核细胞基因表达载体的构建另一类是质粒载体，而且常常是穿梭质粒载体，即在细菌和哺乳动物细胞两者体内都能扩增。构建此类载体一般含有如下基本成分：（1）允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。多数含有质粒pBR322或其衍生载体pAT153的序列，包括能使质粒在细菌体内复制的起始位点和抗生素标记基因（2）含有能使基因转录表达的调控元件，在5’端转录起动需要有启动子，包括帽状位点（RNA转录起始点）上游约30碱基处的TATA框和上游70~90碱基处的CAAT框序列和增强子。当前构建载体的许多启动子序列都来自病毒。也有其它来源的启动子。此外，在基因3’端应有终止序列、RNA3’端的切割序列和polyA序列等。近来有人在载体里加入显性活动调控区（DCR）序列，以此来克服因载体整合在宿主基因组位点而产生的表达水平降低。1、真核细胞基因表达载体的构建1、真核细胞基因表达载体的构建（3）能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。一般有两类标记：一类仅适合用于密切相关的突变细胞株，如采用标记基因hgprt、tk和aprt等基因，它们仅适用于hgprt-（次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型）、tk--（胸苷激酶缺陷型）和aprt--（腺嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型）等基因缺失的细胞株。另一类是显性作用基因，如neo基因，它能使氨基糖苷抗生素—新霉素磷酸化而失活，从而使原来对新霉素敏感的哺乳动物细胞一旦获得含该基因的载体后，就能在含该抗生素的培养基中存活。（4）有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。最常用的是编码二氢叶酸还原酶的基因。该酶的扩增可防止氨甲喋呤（MTX）对细胞的毒害作用。利用该原理，在构建载体时可有意识地将它与目的基因重组在一起，当在培养基内增加MTX浓度时，就会促使dhfr基因的扩增，同时也会使其毗邻的目的基因随之扩增，从而大大提高表达量。类似的扩增系统还有谷氨酰胺合成酶和腺苷脱氢酶等系统。1、真核细胞基因表达载体的构建2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选（1）DNA导入动物细胞方法：

融合法化学法物理法病毒法细胞融合法DNA-磷酸钙沉淀法

电穿孔法重组逆转录病毒脂质体介导法DEAE-葡聚糖法显微注射法重组DNA病毒原生质融合法染色体介导法基因枪法多瘤病毒样颗粒微细胞介导法鬼影红细胞介导法介导法介导法2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选（2）筛选：外源基因导入动物细胞的效率是很低的，首先要依靠构建载体内的选择标记采用相应的筛选系统，如用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择系统，筛选tk+、hgprt+的转化细胞；用G418（Geneticin）选择系统，筛选Neor的转化细胞；用MTX选择系统，筛选dhfr+的转化细胞，等等。其次是对选出的细胞进行克隆和亚克隆使其纯化。最后在多数情况下需利用其扩增系统，不断增加其基因拷贝数，从而获得高效表达而稳定的工程细胞株。2、基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选五、细胞库的建立除原代细胞外，其它的细胞株、细胞系都需要建细胞库加以保存。按照我国和美国FDA的规定，用于生产的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（mastercellbank，MCB）和生产用细胞库（manugacture’sworkingcellbank，MWCB）或称工作细胞库（workingcellbank，WCB）。五、细胞库的建立储存于MCB的细胞应该是单一来源的均质的细胞，对于二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。储存时应具有该细胞详细档案，包括：（1）该细胞系的历史：来源、动物的年龄和性别、细胞分离的方法和所用的培养材料等（若来源于人，则还需要知道该人的病史，以便检查是否存在着病原体）；（2）该细胞的特性：形态、生长特性如倍增时间和分种比等。种源的特性，如核型、同工酶、细胞抗原、以及特异的标记染色体等。若是用于生产的重组细胞，在需有载体构建的资料、基因拷贝数、表达产物的性质和产量及其稳定性等。（3）对各种有害因子的检查结果：细菌、真菌、支原体和各种病毒，包括逆转录病毒等。培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等

冻存液：培养基和防冻液名称

细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性

培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量

细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性

核

型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无

无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等

物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测

免疫检测：一两种血清学检测

细胞建立者：建立者姓名；检测者姓名

五、细胞库的建立储存于MWCB的细胞应该是从MCB来的，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的，然后经培养扩增到一定数量后，再分装储存形成的细胞库。同样该细胞库也必须建立档案，而且需要进行无菌性和无细胞交叉污染的检查。生产时需确定其最高使用的传代数。第四节动物细胞的培养条件和培养基为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些基本条件：（1）绝对无菌操作；（2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其微量的离子掺入；（3）适量氧气供应；（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物；（5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透压和离子浓度等；（6）及时分种，保持合适的细胞密度。第四节动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件二、动物细胞培养基的种类和组成一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗和消毒器材的清洗：一般来说，需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢。器材的消毒灭菌：主要通过物理方法和化学方法来达到严格无菌的操作过程。尽量避免使用抗生素，但在工业生产中还是经常使用的。常用抗生素及其浓度见表3-5一、动物细胞的培养条件2、水质蒸馏、离子交换、电渗析、反渗透、中空纤维过滤等单独使用或配合使用，制备纯水，一般要求金属离子含量很低，电阻值在18M

以上。动物细胞制药用水，要求去热源。一、动物细胞的培养条件3、pHpH的高低对细胞各种酶的活性、细胞壁的通透性以及许多蛋白的功能都有重要的影响。动物细胞培养的最适pH为7.2~7.4，低于6.8或高于7.6时会对细胞产生不利影响，严重时会引起细胞退变甚至死亡。一般来说，传代细胞比原代细胞对pH变动的耐受性强，细胞量多时比细胞量少时耐受性强。细胞代谢也会造成pH变化，可用缓冲体系来稳定细胞周围环境的pH。书中给出了部分缓冲体系，可以参考。一、动物细胞的培养条件4、渗透压在细胞培养的所有操作中，为了使与细胞接触的所有液体都保持有较合适的渗透压和pH，一般都需要使用平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS），它由无机盐和葡萄糖组成。表3-6列出了几种常用平衡盐溶液（BSS）组成/g·L-1。二、动物细胞培养基的种类和组成细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，可大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640以及ISOCOV、199和McCoy等，构成这些培养基的主要成分见书中表3-7。二、动物细胞培养基的种类和组成上述合成培养基中主要有氨基酸、维生素、糖类、无机盐以及其它一些特定成分如核酸的前体腺苷、鸟苷等。为了给细胞培养以更大的方便，以便于其增殖或贴附生长，常向培养基中加入一定量的动物血清，常用的是添加5%~10%的小牛血清，杂交瘤细胞的培养中，血清可能要求的更高，常用10~20%的胎牛血清。血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生长增殖所需要的各种生长因子和激素；（2）提供有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子；（3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。二、动物细胞培养基的种类和组成3、无血清培养基无血清培养基的优点如下：①提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批之间差异的影响；②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；③供应充足、稳定；④细胞产品容易纯化；⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于实验结果的分析。目前已经有市售无血清培养基（书中表3-8所示）。无血清培养基中都是在合成培养基内加入不同种类的添加剂所构成，大致有以下几类：（1）激素和生长因子：使用最多的是胰岛素，促进糖原和脂肪酸的合成，对细胞生长有刺激作用。

（2）结合蛋白：最经常被补充的是铁传递蛋白和白蛋白。为了便于纯化，有时可用硫酸亚铁、柠檬酸铁、葡萄糖酸铁代替铁传递蛋白。

（3）贴附和伸展因子：目前多数无血清培养基只适用于悬浮细胞，真正能用以培养贴壁细胞的很少，也很贵，原因在于它们均缺少必需的贴附和伸展因子，除这些因子外，有的还添加维生素A酸和重组的小肽，它可与细胞的受体结合。

（4）其它有利于细胞生长的因子和元素：它们包括有消除氧自由基损害的谷胱甘肽，某些微量元素，如硒等。第五节动物细胞培养的基本方法细胞培养的方法，一般可以根据细胞的种类分为原代和传代培养；又可以根据培养基的不同分为液体培养和固体培养；还可以根据培养容器和方式不同分为静止培养、旋转培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固定化培养等。其基本技术都是类似的，介绍细胞培养必须掌握的基本方法和技术。一、细胞分离1.离心分离法主要用于从含有细胞的体液如血液、羊水等中分离细胞。800～1000r/min离心5～10min即可。2.消化分离法该法是先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细胞。常用的消化物有胰蛋白酶、EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶等。1.胰蛋白酶胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。胰酶在pH8.0、37℃时消化能力最强。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。细胞传代使用的胰酶浓度是0．25％或0．2％。用于原代细胞培养消化组织块则为0．1％或0．125％。Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。BSS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。配制1％胰蛋白酶消化液

1．D．Hanks液高压灭菌之后，晾至室温，4℃保存备用。

2．称取10g胰蛋白酶粉末加入少量D－Hanks液调成糊状，再补足4℃预冷的适量D-Hanks液至1000ml，4℃下磁力搅拌使完全溶解。

3．用NaHC03干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右(胰酶作用的最适pH值)

4．分装成小份，过滤除菌，－20℃冻存。用时用D．Hanks液稀释成0.25％或0.125％二、细胞计数（1）

细胞形态观测及活细胞计数：计算细胞数目可用血球计数盘或是粒子计数器自动计数。粒子计数器：电子细胞自动计数器，它的原理是让一定体积的细胞悬液经一小孔，并在两个电极间通过，此时通过的细胞就会对电极间的电流产生干扰而使电压发生改变，这样就会在电子计数器上形成一个信号被记录下来。该法的优点是计数速度快，缺点是无法分辨活细胞和死细胞，并会误将细胞结团当作单个细胞记录下来，使计算数值偏低。血球计数板计数：先根据情况用培养基将细胞悬液作适当稀释，然后用吸管吸取少量悬液，滴于计数板上的盖玻片一段，让液体自动进入盖片下方间隙。镜下观察并计数。压线只计上线和右线的细胞。血球计数盘一般有二个室，每个室中细刻9个1mm2

大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中的细胞数目。

血球计数板

4大格细胞总数细胞数=—————————×104×稀释倍数

4镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。范例：

T75monolayerculture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml台盼兰混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内。

细胞数目。

活细胞数/方格：55,62,49,59

死细胞数/方格：5,3,4,6

细胞总数=243

平均细胞数/方格=60.75

稀释倍数=2

细胞数/ml：60.75x104x2=1.22x106

细胞数/flask：1.22x106x10ml=12.2x106

存活率：225/243﹦92.6%(2)细胞活力检测染料排除法台盼兰苯胺黑藻红B结晶紫——活细胞着色

死细胞着色

MTT法：活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶可将黄绿色的MTT降解成兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。通过比色可测定存活率。存活率=活细胞数/总细胞数×100%三、细胞的传代细胞增值到一定程度，由于各种因素的限制，如不及时分种，细胞就会死亡、脱落。故在细胞的培养过程中要及时的传代。1.悬浮细胞的传代较容易，只要加入一倍或几倍的生长液，然后分钟两只或多只培养瓶即可。2.贴壁细胞的传代需经消化液消化后再分种。(1)

细胞长满瓶底后，换液，弃去旧培养液，用PBS洗两遍，加入新鲜培养液。(2)

次日消化细胞；弃去原培养液，用PBS洗两遍，加入消化液（0.25％胰蛋白酶：0.1％EDTA＝1：1），室温放置2～5min。(3)

弃去胰酶溶液，加入等量培养液终止胰酶消化，吸管吹打，使成单细胞悬液。(4)

把细胞悬液转移至离心管。4℃，1000g离心10min，弃上清。(5)

加入新培养液悬浮细胞成单个细胞，制成细胞悬液，并计数细胞密度。(6)

在预传代的瓶中加入新培养液，把细胞悬液加入到预传代细胞瓶。注意事项：消化前需先观察细胞有无污染加入消化液的量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为度。消化时间不宜过久，一般静置2～5min，当细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。终止消化要去掉消化液，然后加入有血清的培养基。分种量的多少取决于细胞数和细胞特性，多数为1传2或1传3为好。已培养过的瓶子可再次使用，但一般不要超过2～3次二倍体细胞培养时每次传代必须写上传代次数。传代后一般每天或隔一天换液，每3～5天传代一次。四、细胞的冻存和复苏1.细胞的冻存细胞在低温时代谢降低，从而大大的延长了它的存活时间。为了保存细胞，都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。冻存过程中，渗透压的改变会影响到脂蛋白，使细胞膜破裂。为了防止电解质过分浓缩，可采用某些保护剂，如甘油或二甲基亚砜。冷冻时，冷冻速度不能太快也不能太慢，一般要求以1℃/min的速度下降为宜。可采用下面几种方法：将安培瓶放在壁厚1.5cm的聚乙稀盒内，然后放在-70℃内2h，再转入液氮。先将安培瓶置4℃4～5h或过夜，再放在-70℃内2h，然后再悬于液氮罐颈口1h，最后浸入液氮。放在冻存简易装置内，置于液氮罐颈口，离液氮面5～10cm，2～3h后浸入液氮。实例：(1)选取对数增长期细胞，在收集细胞前24小时换液一次。(2)按常规方法把培养细胞消化下来，制备成细胞悬液，计数，使总数达2×106/mL左右，离心（1000g，5min）,去上清。(3)用等量冻存液（含20％小牛血清，10％DMSO的DMEM培养液），用吸管轻轻吹打成细胞悬液。(4)分装入冻存管中，拧紧，用封口膜封严；分别于冻存管管壁和管盖编号。(5)将冻存管放入冻存袋中，并在冻存记录本上注明位置，细胞名称，冻存日期；(6)将冻存袋装入液氮罐中，以1℃/min的速度，在30

40min之内下降到液氮表面，再经30min后，投入液氮中（定速降温设备）。或者先放在

20℃冰箱放置2h，然后转入

80℃冰箱，可以

80℃冰箱一直冻存或者1

14天后转入液氮冻存。注意事项：冻存的细胞处在良好的营养状态，故在冻存前一天要换液培养细胞密度以1×106～2×106/ml为好。配制冻存用培养基要与实际使用的一致，另加保护剂二甲基亚砜或甘油10％，二甲基亚砜用过滤灭菌。安培瓶封口后要检查其密封性。标签上写上细胞的名称，编号和冻存日期细胞的复苏要求：快融。操作：

(1)把从液氮中取出的冰冻细胞，立即将冻存管放入42℃水浴，待其将融化后，用酒精棉球擦净，把细胞悬液转入离心管，再慢慢补加少量培养液；(2)离心（1000g，5min），弃上清用培养液轻轻悬浮细胞；再离心（1000g，5min），弃上清，再用培养液悬浮细胞，接种到培养瓶培养。(3)次日更换一次培养液后，按常规培养。细胞冻存：1.取生长状态好的细胞制成悬液，2.离心洗涤，3.加含10%DMSO动存液4.加入安培瓶，5.熔封，6.-70℃放置2-3h，7.移入液氮罐，8.记录

细胞复苏9.取出安培瓶放入37℃水浴中，10.消毒安培瓶开封将细胞移入离心管家培养基离心，11.计数，12.接种培养瓶培养。注意：为防止安培瓶爆炸，一定要戴面罩和手套从液氮罐取出后应立即丢入成有37～42℃温水的搪瓷杯内，并搅动加速融化。用乙醇消毒安培瓶外表由于DMSO对细胞有一定的毒性，故应尽早去除。或立即离心，换上新鲜培养基；或先将细胞悬液直接种入培养瓶内，4～6h后，待细胞贴壁后立即换液隔天观察细胞生长情况，再换液一次。第六节动物细胞培养的方法和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法从生产实际来看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。二、动物细胞培养的操作方式无论是哪种培养，其操作方式与细菌培养一样，一般可分为分批式操作、补料-分批（或流加式）操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作，其中补料-分批（或流加式）操作在用细菌生产时被普遍采用，但在动物细胞培养中用得较少。其中分批式、半连续式和灌流式比较重要。一、动物细胞大规模培养的方法1、悬浮培养（suspensionculture）适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。操作简便，培养条件比较均一，传质传氧能力强，容易扩大培养规模。但是培养密度不高目前生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。2、贴壁培养一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度；不足之处是操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧效果差。另一种被普遍采用的贴壁培养方法是固定床式生物反应器（由连续流动的液体底物和静止不动的固定化生物催化剂组成，另外，也可以由连续不动的气体和静止不动的固体底物和微生物组成）。但由于该反应器中传质和传氧常出现梯度式不均一现象，故放大受到限制。贴壁培养和悬浮培养的另一个不同之处是在传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从基质上消化下来。一、动物细胞大规模培养的方法3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养（1）微载体培养：创造大的贴附面积，供细胞贴附生长增殖，载体体积小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥悬浮培养的一切优点。理想的微载体应具备：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.030~1.045g/ml）、粒径均一，在60~250

m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。80年代以后发展的多孔微载体或微球，有商品出售。一、动物细胞大规模培养的方法（2）包埋或微囊培养：将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。一般载体材料为：人工合成的polymer、糖类如纤维素等、蛋白质如胶原、纤维蛋白等。此方法的优点之一是可采用多种生物反应器进行大规模培养。（3）结团培养：利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了用于微载体的成本。二、动物细胞培养的操作方式1、分批式操作一种是将细胞和培养基一次性加入反应器内进行培养，此后细胞不断增长，产物不断形成和积累，最后将条件培养基（conditionedmedium），即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反应器，待细胞生长至一定密度后，向反应器内加入诱导剂或病毒等，经一端时间作用后，将反应物取出，如产生Namalwa干扰素和疫苗等。二、动物细胞培养的操作方式2、半连续式操作该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用，它的优点是操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。二、动物细胞培养的操作方式3、灌流式操作该方式是当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养基。它与连续式操作不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保留在反应器内，而连续式培养则同时也取出了部分细胞。该操作方式是近代用动物细胞培养生产各种药品最被推崇的方式。它的优点是：①细胞可处在较稳定的良好的环境中，有害代谢物浓度低；②可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量；③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；④培养基的比消耗率较短，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。二、动物细胞培养的操作方式灌流式操作在某些生物反应器中是唯一可行的操作方式，如中空纤维生物反应器、固定床或流化床式反应器、膜式生物反应器等。在这些反应器中，细胞已被固定，在取出部分条件培养基和补充新鲜培养基和补充新鲜培养基时，细胞基本上都被保留反应器中，故采用该操作不存在困难。但在微载体培养、悬浮培养和结团培养中，就存在一个如何使条件培养基和细胞、载体分离的问题。为了解决该问题，目前采用的方法有与旋转轴连在一起的滤网、有专门用于悬浮细胞的中空纤维分离器、超声波分离器和靠微载体自重沉降分离的上细下粗的排液柱以及靠离心分离的专用离心机等。菌种筛选摇瓶试验发酵罐试验第七节动物细胞生物反应器及其检测控制系统理想的动物生物反应器必须具备如下一些基本要求：①体系中的其它材料，对细胞必须无毒性；②生物反应器结构的传质、传热和混合性能好；③密封性能良好，可避免一切外来微生物的污染；④培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制，控制的精确度高，且能保持环境质量的均一；⑤可长期连续运转，尤其对于动物细胞而言；⑥容器加工制造时要求内面光滑，无死角；⑦拆装、连接和清洁方便，耐高压蒸汽消毒便于操作消毒；⑧设备成本尽可能低。反应器可分为实验室规模、中试规模和生产规模。第七节动物细胞生物反应器及其检测控制系统一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构；二、动物细胞生物反应器的检测控制系统；一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构1、搅拌罐式生物反应器通过借鉴细菌发酵罐得到的动物细胞反应器，有如下特点：（1）罐体的高径比一般采用1~1.5：1，利于增大与空气的接触面；培养动物的罐底为圆形，以避免细胞和载体沉积在周边；（2）为防止搅拌产生的切力损伤细胞，搅拌速度慢，一般在20~100r/min，故多数倾向于采用较大的倾斜式桨叶搅拌器或船舶推进式桨叶搅拌器（3）一般采用无气泡通气系统，以解决由于气泡破裂时产生的应力对细胞的损伤；（笼网或聚丙烯中空纤维膜、透气的硅胶管）（4）高密度、长时间培养以及提高反应器的生产效率考虑，反应器常常需要配备有进出液体系统，以便进行灌流培养，并有使细胞与培养基分离使细胞保留在反应器内的装置。搅拌罐式生物反应器在目前仍然是重要的生产设备。一、动物细胞生物反应器的类型和其基本结构2、气升式生物反应器该反应器的特点见图5-4，与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小，混合均一，氧和营养的传递好，由于没有了机械搅拌的结构，有利于设备的密封，降低了造价。操作无噪音；料液可充满达80～90％，而不需加消泡剂；维修、操作及清洗简便，减少杂菌感染。方便PH