分子生物学研究方法-9

分子生物学研究方法

一、重组DNA技术发展史上的重大事件三大理论基础：1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；

3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。三大技术支持1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了限制性核酸内切酶。1972-1973

H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977

F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；1983

获得第一例转基因植物。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2003年人类基因组计划完成，中国1%，基因工程中常见的名词:

遗传工程--geneticengineering基因操作--gonemanipulation基因克隆--gonecloning重组DNA技术--recombinantDNAtechnology分子克隆--molecularcloning。基因工程的主要内容或步骤:1.从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。

2.将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。

3.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。

4.从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。

5.将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需物质。二、基因操作的主要技术原理1．核酸的凝胶电泳(Agarose)2．核酸的分子杂交技术3．细菌的转化4．DNA序列分析5.基因的定点诱变（site-directedmutagenesis）6．利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究1．核酸的凝胶电泳将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的摩擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。

在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidiumbromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA所形成的条带。核酸杂交技术从Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。60年代中期Nygaard等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。2．核酸的分子杂交技术70年代末期到80年代早期，分子生物学技术有了突破性进展，限制性内切酶、载体系统的发展和应用。固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备18～100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因，大大提高了杂交水平和可信度。核酸杂交反应首先经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，然后通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。

将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。核酸杂交也称印迹杂交。核酸杂交技术与其它技术相结合广泛应用于特定基因的表达、基因定位、遗传病的检测、组织病理学的研究、生物分类方面。核酸分子杂交的基础是通过碱基对之间非共价键（主要是氢键）的形成出现稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA（Southernblot）、RNA与RNA(Insitu)或RNA与DNA(Northernblot)的二条单链之间进行。由于DNA一般都以双链形式存在，因此在进行分子杂交时，应先将双链DNA分子解聚成为单链，这一过程称为变性，一般通过加热或提高pH值来实现。

是指将核酸分子固定在纤维膜上的过程。将核酸从电泳后的凝胶中转移到膜上或直接将核酸点到膜上。是核酸杂交过程中的主要步骤之一。转膜关键步骤探针标记标记方法：缺口平移、末端标记、随机引物延伸、聚合酶链反应等。核酸探针的种类：DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核酸探针。选择标记方法：一般认为放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。在对灵敏要求不高时，可采用生物素探针技术杂交的方法：菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）点杂交（Dotblot）Southern印迹杂交（Southernblot）Northern印迹杂交（Northernblot）组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）等。菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）点杂交（Dotblot）将被检测标本点到膜上，烘烤固定。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot(Bio–Rad)和Hybri–Dot,它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交。Southernblot是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断DNA图谱分析、特定基因组的分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交（Southernblot）基本方法将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Westernblot。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合以及保持其单链状态。Northern印迹杂交（Northernblot）不同之处：没有酶切组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。原位杂交是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此,原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置，例如，与细胞RNA的杂交可精确分析一种RNA在细胞中和组织中的分布。组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）3．细菌的转化细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自外源DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（CompetentCells）,质粒DNA中的抗生素是筛选标记。

4．DNA序列分析a.Sanger的双脱氧链终止法b．Maxam-Gilbert化学修饰法Sanger的双脱氧链终止法Cambridge的F.Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：

①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2‘，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3‘-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），dA，dT，dG，dC和一种ddNTP和DNA聚合酶。

2'，3'ddNTP与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3'羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸。DNA聚合酶通常用于双脱氧法序列测定的有几种不同的酶：大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段反转录酶测序酶TaqDNA聚合酶：从嗜热水生菌分离的耐热DNA聚合物。测序中的关键酶类（1）大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段最初用以建立Sanger法的酶，至今仍广泛用于DNA序列测定。不足：1）Klenow片段的持续合成能力低，以致一些片段并非由于ddNTP的掺入，而是因为聚合酶在模板上随机解离而终止合成，因而导致背景增高。由于该酶不能沿模板进行长中距离移动，因此利用该酶进行的标准测序反应所得序列的长度有限。通常，这一反应只能得到大约250-350个核苷酸的序列。2）Klenow酶对模板中的同聚核苷酸段或其他含牢固二级结构的区域进行复制的效能很低。将聚合反应的温度提高到55℃，可以缓解但并不能彻底解决这一问题。因此，Klenow片段仅测定250个碱基以内的一段DNA序列，不宜用它来测定更长一段DNA序列或者具有二重对称和（或）同聚核苷酸段的DNA序列。

2）反转录酶不是测序工作中广泛使用的酶，主要用于解决一些由于模板DNA中存在A/T或G/C同聚核苷酸区而引起的问题。反转录酶测序效果比比Klenow酶略胜一筹。

3）测序酶T7噬菌体DNA聚合酶，化学修饰消除3‘→5’外切酶活性。特点：极其稳定、高活性、持续合成能力很强、聚合速率很高。测定长段DNA序列的首选酶。测序酶可以沿模板移动很长的距离，因而一套反应常常就可以测定数百个核苷酸的DNA序列。实际上，测得序列的长度更多是受聚丙烯酰胺凝胶的分辨能力而不是受该聚合酶的特性所制约。（4）TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶适用于测定稳定一级结构的单链DNA模板序列。这是因为TaqDNA聚合酶在70-75℃活性最高，这一温度下即使GC丰富的模板也无法形成二级结构。这种酶的持续合成能力甚佳。TaqDNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94，000Da。具有5`-3`的聚合酶活力，5`-3`的外切核酸酶活力。不具有3`-5`的外切核酸酶活力，会在3`末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A），在离体反应中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-4--10-5。测序型的TaqDNA聚合酶经修饰，具有较低的5`-3`外切酶活力，有利于在测序中获得均匀强度的片段和低的背景。延伸反应在70℃进行，可消除