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文档简介
毛细管电泳电化学检测法测定蛛香根中主要生物活性成分的含量
1生物活性物质蜘蛛虱子。其入药部分一般为干燥根茎,具有镇静安神、理气止痛、祛风除湿、消炎止泻等功效,可用于治疗脘腹涨痛,消化不良,腹泻,痢疾,风湿痹痛,腰膝酸软等病症。对其化学成分进行的大量研究发现,环烯醚萜类、黄酮类和酚酸类化合物是其主要的生物化学成分。现代药理实验表明,黄酮类化合物能预防癌症,咖啡酸和绿原酸等酚酸类物质则具有抗氧化性、抗诱变性和抗癌活性。目前,蜘蛛香中挥发性成分、脂肪酸和萜类化合物等成分的检测,主要有薄层扫描法、GC-MS、高效液相色谱法和气相层析-质谱联用等方法。毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、重现性好、样品和试剂用量少等优点,是一种高效的分离分析技术。与电化学检测方法联用,CE-ED对电活性物质具有很高的灵敏度和选择性。本研究首次采用CE-ED,分别测定了不同产地蜘蛛香根中香叶木素、山奈酚、芹菜素、绿原酸以及咖啡酸等5种多元酚类化合物,建立了一种分离检测蜘蛛香根中活性成分的简便、可靠、灵敏的新方法。2实验部分2.1毛细管、工作电极的组装毛细管电泳电化学检测系统(CE-ED)为自组装。包括±30kV高压电源(中国科学院上海应用物理研究所);BASLC-4C安培检测器(美国生物分析系统公司);EB100型台式单笔记录仪(上海大华仪表厂);Model14901三维微定位器(斯特拉特福,美国康涅狄格州);75cm长熔融石英毛细管(内径25μm,外径360μm,河北永年锐沣色谱器件有限公司);毛细管、检测池和三电极体系均组装在一个带有微动开关的树脂玻璃框架中,以保证仪器和操作人员的安全。当框架打开时,微动开关会自动切断电源。工作电极为300μm的碳圆盘电极,使用前先用金相砂纸抛光,并置于二次蒸馏水中超声清洗5min,然后借助三维微定位器,使工作电极与毛细管出口在一条直线上,并尽可能靠近毛细管的末端。铂丝为辅助电极,饱和甘汞电极为参比电极。用BASLC-4C安培检测器检测氧化电流,电泳图谱由单笔记录仪记录。采用电迁移进样,使用16kV电压从毛细管阳极端进样8s,检测池为阴极电泳池。2.2样品的配制和过滤山奈酚、芹菜素、绿原酸和咖啡酸标准品购自Sigma公司;香叶木素购自中国药品生物制品检定所。5种标准储备液浓度均为1.00×10-3g/mL,用无水乙醇(分析纯)配置,避光4℃保存。其它不同浓度的工作液,用运行缓冲液(pH值8.7~9.5,浓度为50.0mmol/L的硼砂溶液)稀释得到。所有分析样品均经0.22μm聚丙烯滤膜过滤后进样。四川蜘蛛香根由第二军医大学药学院提供,贵州蜘蛛香根购自贵阳市药店。2.3超声萃取-滤纸过滤将两种产地蜘蛛香的根磨成粉状,分别准确称取2.0g,用10mL、80%乙醇溶液∶去离子水=4∶1(V/V)超声萃取1h后,先用滤纸过滤,再用0.22μm聚丙烯滤膜过滤,将得到的滤液放于阴暗处保存。3结果与讨论3.1所需的电泳条件3.1.1种组分的电化学特性电化学检测是基于被测物质能够在碳电极上发生电化学氧化的性质。上述5种组分由于带有酚羟基,均具有较好的电化学活性,且电极电位直接影响被分析物的电化学响应,因此为了选择最佳工作电位,对5种组分的流体伏安曲线进行了测定(如图1)。当电极电位超过+500mV(vs.SCE)时,5种组分均产生氧化电流。随着电极电位的增大,香叶木素和芹菜素的氧化电流增加迅速,而其它3组分的响应受氧化电位影响较小。当电极电位大于+950mV时,虽然香叶木素和芹菜素的氧化电流仍稍有增加,但此时本底电流大幅增加,噪音明显提高,而导致基流不稳。所以选择检测电位为+950mV(vs.SCE),此时信噪比较高,电极的稳定性好。3.1.2缓冲液ph值对迁移时间的影响在碱性溶液中,硼酸盐能与待测物螯合生成配位阴离子来增加溶解度,减少了因吸附造成的峰拖尾等影响,所以选用硼砂作为缓冲体系。如图2所示,在pH8.7~9.5范围内5种组分随着pH值的提高,迁移时间明显延长,且pH值为9.2~9.5时,5组分可实现基线分离。当pH值低于9.00时,绿原酸与山奈酚不能实现分离,而pH值过高会导致待测物被氧化。故选择缓冲溶液的酸度为pH9.23。此时被测物可以完全分开,且分析时间较短。毛细管内壁的zeta电位与运行缓冲液的pH值和浓度或离子强度有关。在固定的pH值下,有效zeta电位随着缓冲液浓度的增加而降低,从而降低了电渗流,使迁移时间变长。本实验在pH9.23、缓冲溶液浓度20.0~100.0mmol/L范围内,研究了运行缓冲液浓度对被测物迁移时间的影响,最佳缓冲液浓度为50.0mmol/L。3.1.3进样时间的选择在一定的毛细管长度下,分离电压决定电场强度。而电场强度影响电渗流速度和荷电物质迁移率,继而决定了分析物的迁移时间。分离电压越高,5组分迁移时间越短。当分离电压超过18kV时,实际样品中待测物不能与其它物质达到基线分离,且基底噪音增大。因而,选择16kV为最佳分离电压,在23min中内所有组分即可得到很好的分离。进样时间决定分析样品的进样量,影响峰电流和峰形。在16kV下,研究了2~12s范围内进样时间对进样量的影响。峰电流随着进样时间的增加而增加(如图3)当进样时间大于8s时,峰高趋于稳定,但峰扩展明显。故在此实验中,选择8s(16kV)作为最佳进样时间。在优化条件下,香叶木素、绿原酸、山奈酚、芹菜素和咖啡酸在23min内即可达到基线分离,所得标准溶液的电泳图谱见图4(A)。3.2重建、线性和检出限3.2.1进样及重现性在上述优化条件下,将标准混合溶液(每种标准品的浓度均为2.0mg/L)连续进样7次,重现性良好。峰高的相对标准偏差(RSD)按照出峰次序分别为:1.1%(香叶木素)、3.7%(绿原酸)、2.2%(山奈酚)、1.3%(芹菜素)和3.0%(咖啡酸)。3.2.2咖啡酸的线性范围在最佳分离检测条件下,对一系列不同浓度(5.0×10-4~0.2g/L)的各组分的混合标准溶液,要分别测定。实验发现,香叶木素、山奈酚与芹菜素的浓度与电泳峰电流在5×10-4~0.1g/L范围内均呈现良好线性关系;绿原酸与咖啡酸的浓度与电泳峰电流在1×10-3~0.1g/L范围内均呈现良好线性关系。以y表示峰电流(nA),x表示样品浓度(g/mL),线性回归方程分别为y=1.70×105x+0.07(香叶木素,r=0.9994);y=8.90×104x-0.16(绿原酸,r=0.9991);y=1.39×105x-0.10(山奈酚,r=0.9995);y=3.10×105x-0.10(芹菜素,r=0.9998)和y=9.21×104x+0.07(咖啡酸,r=0.9994)。以信噪比S/N=3对应浓度确定检出限分别为3.8×10-5g/L(香叶木素)、2.0×10-4g/L(绿原酸)、4.6×10-5g/L(山奈酚)、1.9×10-5g/L(芹菜素)和1.0×10-4g/L(咖啡酸)。3.3标准加入法检测化合物中未检出咖啡酸在选定的测定条件下,对四川和贵州蜘蛛香样品中的5种组分进行了测定,电泳图谱见图4(B)和(C)。与标准物质电泳图4(A)相对照,四川产蜘蛛香的根中确实含有香叶木素(1)、绿原酸(2)、山奈酚(3)、芹菜素(4)和咖啡酸(5);而产自贵州的蜘蛛香根中未检出咖啡酸。测定结果见表1。以州蜘蛛香的根进行了回收率实验。采用标准加入法,3次测得的回收率均在97%~104%之间,平均回收率和相对偏差(RSD)分别为香叶木素(98.6
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