肿瘤淋巴管新生机制研究进展

肿瘤淋巴管新生机制研究进展

肿瘤的转移是其重要的生物学特征之一，也是难以完全治愈的主要原因。许多肿瘤可以通过血管和淋巴管扩散，局部淋巴结转移通常是肿瘤患者最重要的预后因素。肿瘤相关的淋巴管为肿瘤细胞离开原发部位进入局部淋巴结以及远处器官提供了导管通路,人们过去曾经认为肿瘤细胞的淋巴转移是一个被动过程,而现在已经明确肿瘤与淋巴管的相互影响直接促进了肿瘤的转移。因此,明确肿瘤淋巴管新生的分子机制将会有助于肿瘤分子靶向治疗的研究,并应用于抗肿瘤淋巴转移的治疗。1免疫因子参与局部生成的细胞在胚胎时期,淋巴管内皮细胞以“出芽”(sprouting)的方式从静脉中分化出来。研究发现,在小鼠胚胎第9天时,主静脉的背外侧细胞过表达转录因子Sox18,进一步诱导Prox1的表达,在胚胎第10天左右,表达Prox1的淋巴管内皮细胞从主静脉处出现并向背侧迁移,从而形成最初的淋巴结构-淋巴囊,在淋巴囊形成后,淋巴管通过“出芽”进一步扩张,逐渐形成成熟的淋巴脉管系统。另外,淋巴管内皮细胞的“出芽”不仅仅局限于主静脉,在外周的局部血管中也发现了“出芽”现象。除了出芽的形式,也有一些研究发现在外周淋巴管及淋巴囊表面的新生淋巴管并非起源于静脉,而是由成淋巴管细胞(lymphangioblast)分化并进一步发育而形成,Wilting等发现在鸟胚胎的中胚层组织中存在Prox1+/VEGFR-3+的成淋巴管细胞,这些细胞被发现参与了鸟翅膀新生淋巴管的生成。肿瘤淋巴管新生的机制比较复杂,新生淋巴管可能是先前存在的淋巴管通过“出芽”的方式产生,也可能是来源于骨髓的内皮祖细胞参与形成,甚至某些细胞能够直接转化为淋巴管内皮细胞。肿瘤组织内缺氧的微环境能够诱导肿瘤细胞分泌一系列生长因子,其中VEGF-C在诱导淋巴管的生长过程中起着重要的作用,受VEGF-C等生长因子的影响,淋巴管内皮细胞开始增殖,逐渐形成“出芽”,生成新的淋巴管。除了通过“出芽”的方式,来源于骨髓的循环内皮祖细胞也参与了新生淋巴管的形成。1997年,Asahara等首先从外周血中分离出了CD34+/VEGFR-2+的内皮祖细胞,这些细胞可向血管内皮细胞分化,出生后,血管内皮祖细胞主要位于骨髓,在血管损伤、组织缺血和肿瘤发生等病理状态下,血管内皮祖细胞可在细胞因子的作用下从骨髓动员到外周血循环中,参与局部组织的血管新生。2003年,Salven等从胎儿肝中分离出了CD34+的细胞,其中VEGFR3+的细胞同时表达CD133,CD34+/VEGFR3+/CD133+细胞可以分化为淋巴管内皮细胞,提示这些细胞可能是淋巴管内皮祖细胞,此后,关于淋巴管内皮祖细胞的研究逐渐增多,有研究表明,淋巴管内皮祖细胞参与了肿瘤淋巴管新生的过程,例如Tawada等建立绿色荧光蛋白(GFP)小鼠骨髓移植模型,在小鼠胃黏膜下接种胃腺癌细胞,3周后在胃癌周围组织发现了LY-VE-1阳性的新生淋巴管,其中合并有明显的GFP阳性的细胞,这表明骨髓来源的内皮祖细胞参与了胃腺癌淋巴管的生成。Lee等在注射了来源于骨髓podoplanin+细胞的小鼠黑色素瘤模型中检测到淋巴管密度显著升高,因此,他们认为podoplanin+细胞能够起到淋巴管内皮祖细胞的作用。Bogos等发现小细胞肺癌病人血液中CD34+/VEGFR-3+细胞显著增多,并与肿瘤细胞的淋巴结转移密切相关。然而,He等却认为,与肿瘤血管新生的机制不同,肿瘤新生淋巴管并非来源于内皮祖细胞,而是由预先存在的淋巴管通过出芽的方式形成。因此,内皮祖细胞是否参与了肿瘤淋巴管新生还需要进一步研究。除了以上两种方式,巨噬细胞在一定条件下也能直接转化为表达淋巴管内皮细胞标志物的内皮祖细胞,从而进一步分化为淋巴管内皮细胞,一些肿瘤动物模型也证实了巨噬细胞参与了肿瘤相关的淋巴管新生。2采用定量分析方法的肿瘤淋巴结活检肿瘤内部缺氧的微环境能够诱导肿瘤细胞分泌多种淋巴管生成因子,从而促进新生淋巴管的生成,肿瘤新生淋巴管仅由单层淋巴内皮细胞组成,与新生血管相比,其基底膜不完整,缺乏肌层,管壁更薄,因此,肿瘤细胞更易侵入新生的淋巴管,经淋巴管转移至淋巴结,并向远处器官转移。另外,新生的淋巴管内皮细胞能表达多种趋化及黏附因子,进一步促进肿瘤细胞的迁移。淋巴结转移是肿瘤分期的一个重要内容,是肿瘤患者重要的预后指标,早期发现淋巴结转移有助于制定最佳的临床治疗方案。目前,研究发现肿瘤新生淋巴管的形成与肿瘤淋巴结转移密切相关。定量分析肿瘤相关的新生淋巴管将有利于发现早期的淋巴结转移风险,一些评估肿瘤淋巴管新生的参数已经广泛应用于临床及实验研究,包括淋巴管密度(lymphaticvesseldensity,LVD)、淋巴管侵犯、淋巴管生成因子水平等。其中LVD是最常用的评估肿瘤淋巴管新生的参数,过去的大量研究证实LVD与肿瘤淋巴结转移及患者的预后密切相关,LVD可以客观地评估肿瘤内新生淋巴管的分布,有利于判断肿瘤淋巴结转移的风险及预后情况,因此,LVD的定量分析将会是一种很有应用前景的检测肿瘤淋巴结转移的方法。目前定量检测肿瘤LVD的研究方法大多是Weidner等提出的免疫染色计数方法或Chalkley点重叠形态测定法,但是这两种计算方法均需要人工选择肿瘤组织淋巴管丰富的“热点”区域,而对“热点”的选择需要专业的训练以及检查者的经验,因此,这两种计数LVD的方法最大的缺点就是主观性较强,各个实验室之间没有统一的标准,导致实验的可重复性较差。最近JoannaNiemiec等的实验室使用了一种计算LVD的新方法-distributionofpodoplaninstainedvessels(DPV),这种方法不需要选取“热点”区域,只需要在至少有一个淋巴管的视野内计数淋巴管的比例。相对于前面两种方法,后者更省时,重复性更好,并且因为肿瘤内的淋巴管相对比较稀少,所以更适合肿瘤内部的淋巴管计数。既往的研究已经发现新生淋巴管存在于肿瘤内部或肿瘤周围,在头颈部的恶性肿瘤、黑色素瘤、异种移植瘤等过表达淋巴管新生因子的肿瘤模型中,已经发现了增殖的瘤内淋巴管的存在,并且发现瘤内淋巴管密度与淋巴结转移相关。然而,在口腔癌及喉癌等肿瘤模型中虽然发现了瘤内的新生淋巴管,但是,瘤内的新生淋巴管密度却与淋巴结转移无关。Padera等通过对瘤内淋巴管进行四种不同方法的功能试验却发现它们不具备正常淋巴管的功能,并且在小鼠的前列腺癌模型中,抑制瘤内淋巴管新生却并不能阻止肿瘤的淋巴结转移,而功能性的淋巴管仅存在于肿瘤边缘,也就是说,肿瘤边缘的淋巴管对于肿瘤细胞的扩散更为重要。Olszewski等在结肠癌肿瘤内部仅发现极少量的已被压缩的淋巴管,但是却检测到大量微小的、不规则的、椭圆或圆形的密闭的“湖”,并推测正是因为肿瘤内部缺乏通畅的淋巴管,因此从毛细血管渗出的液体不能被排出,所以才形成了充满组织液的“湖”,因此,肿瘤细胞通过瘤内淋巴管扩散似乎也不太可能,相反,肿瘤外周的淋巴管往往呈扩张的状态,其中充满了肿瘤细胞群。另外,原发瘤的位置是否靠近预先存在的小淋巴管对肿瘤细胞的转移也很重要,如果肿瘤发生在毛细淋巴管丰富的组织,比如皮肤中,那么它将更容易发生淋巴管新生及淋巴结转移,毛细淋巴管受到VEGF-C的诱导,可以通过“出芽”的方式向着肿瘤方向生长,这说明了肿瘤周围的淋巴管在肿瘤细胞转移过程中发挥了更为重要的作用。总之,肿瘤与新生淋巴管之间相互影响,肿瘤细胞能够分泌细胞因子,促进淋巴管的新生,而新生淋巴管又能够促进肿瘤细胞的生长及淋巴结转移,评估淋巴管新生的一些参数在相关的临床及基础研究中起着重要作用,找到更客观、更统一、并更容易操作的衡量这些参数的标准将是以后相关实验技术及方法改进的方向之一,这将能够更好地促进肿瘤淋巴管新生的研究。肿瘤外周的淋巴管可能为功能性的淋巴管,其在淋巴结转移中发挥了更为重要的作用,而肿瘤内部的淋巴管是否是功能性淋巴管目前仍有争议,需要将来进一步研究。3vegf-c信号途径在胚胎淋巴管新生中的作用VEGF-C是VEGF家族的重要成员之一,其基因位于人类染色体4q34上,编码一种含419个氨基酸残基的蛋白,相对分子量为46900。VEGF-C通过与淋巴管内皮细胞上的膜型酪氨酸激酶受体VEGFR-3结合后,通过一系列复杂的细胞内信号传导,最终引起淋巴管内皮细胞增殖,促进淋巴管生成,并且影响淋巴管内皮细胞表面的分子表达,VEGF-C/VEGFR-3信号途径在淋巴管新生中起着重要的作用。在胚胎10.5天左右,颈静脉周围的间质细胞表达VEGF-C,从而形成淋巴管内皮细胞出芽。对基因敲除鼠的研究进一步揭示了VEGF-C/VEGFR-3信号途径的重要作用,在VEGF-C基因敲除的小鼠胚胎10.75天左右,Prox1+的淋巴管内皮细胞大量聚集在总主静脉,但是,在主静脉以外的区域却检测不到Prox1+的淋巴管内皮细胞,说明淋巴管内皮细胞不能从主静脉中迁出从而形成淋巴囊。而且,在新生小鼠体内注射重组腺病毒编码的VEGFR-3-Ig,结果导致其淋巴管的完全缺失,这表明了VEGF-C/VEGFR-3信号途径在胚胎淋巴管新生中起着重要的作用。大量动物模型揭示了VEGF-C/VEGFR-3信号途径在肿瘤淋巴管新生中的重要作用,包括乳腺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、结肠癌、肺癌等在内的大量动物模型均证实了VEGF-C能够促进肿瘤淋巴管新生、并且促进肿瘤细胞沿淋巴管转移。在乳腺癌的同源模型中,Shibata等采用小干扰RNA技术抑制VEGF-C的表达能够抑制淋巴管新生,减少淋巴结转移及肺转移。Shi等建立人胰腺癌细胞系B×PC-3裸鼠动物模型,经VEGF-CShRNA处理后检测肿瘤组织中VEGF-C的表达和D2-40标记的肿瘤淋巴管密度,结果证实VEGF-CShRNA能明显抑制VEGF-C的表达,同时肿瘤组织内淋巴管密度明显减少。Huang等采用RT-PCR技术检测子宫内膜癌动物模型中的VEGF-CmRNA,发现在腹膜后淋巴结转移的肿瘤模型中,腹膜后淋巴结中的VEGF-CmRNA水平较无腹膜后淋巴结转移组明显升高,说明VEGF-C在子宫内膜癌的腹膜后淋巴结转移中起着重要作用,或可以作为子宫内膜癌预后的预测因子。除了动物实验模型,VEGF-C/VEGFR-3与肿瘤淋巴管新生的关系在临床病理研究中也得到了验证,在结肠癌、肺癌、乳腺癌等患者的肿瘤标本中发现VEGF-C不仅能够促进肿瘤淋巴管新生及肿瘤细胞的淋巴管转移,并且能够作为判断肿瘤临床预后的生物标志物。Tanaka等分析了106例已行食管癌根治术的食管鳞癌患者,发现肿瘤分期在Ⅱb-Ⅳa的患者VEGF-C水平表达高于分期在0-Ⅱa的患者,依据VEGF-C表达水平分成两组分析,发现VEGF-C高表达者其淋巴结转移发生率明显高于低表达者。综上所述,VEGF-C/VEGFR-3反应轴不仅能够促进肿瘤淋巴管新生,而且可促进肿瘤的生长和转移,在肿瘤淋巴管转移通路中起着至关重要的作用。4sdf-1和cxcr4在肿瘤组织转移中的作用SDF-1是CXC趋化因子家族成员之一,也被称为CX-CL12,CXCR4是其特异性受体之一,由352个氨基酸构成,α螺旋跨膜7次。SDF-1/CXCR4反应轴通过SDF-1与其受体CXCR4特异性结合,激活下游信号通路,发挥其生物学效应。SDF-1和CXCR4在许多器官如肝脏、肺、肾、脑、心脏等均有广泛地表达,过去的大量研究证实SDF-1/CXCR4反应轴不仅介导免疫及炎症反应、还能够调控造血干细胞迁移及归巢、参与胚胎发育过程等,当发生缺氧、中毒或者放射损伤时,大量的组织通过增加CXCL12的分泌及表达来招募CXCR4阳性的干细胞或祖细胞到达需要组织再生的位置,这表明CXCL12还可以作为一个紧急的救助信号来开始引起组织的再生及修复。最初,在慢性淋巴细胞白血病患者中首先发现了SDF-1及其同源受体CXCR4在B淋巴细胞的转移及组织定位中起着重要的调控作用,随后,关于SDF-1/CXCR4反应轴与肿瘤相关的研究逐渐成为热点,包括乳腺癌、肺癌、肾癌、脑癌及各种类型白血病等在内的超过75%的肿瘤,CXCR4在其肿瘤细胞的扩散及转移过程中均起着至关重要的作用,并且,SDF-1/CXCR4还能够直接促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤的血管新生,SDF-1不仅通过与CXCR4相互作用从而刺激肿瘤生长,还能够招募内皮祖细胞到达肿瘤部位从而促进肿瘤血管新生。SDF-1/CXCR4反应轴在肿瘤淋巴管新生及淋巴结转移过程中也发挥着重要作用。研究表明,缺氧能够诱导淋巴管内皮细胞上调SDF-1的表达,同时上调肿瘤细胞CXCR4的表达,肿瘤新生淋巴管的内皮细胞分泌SDF-1,利用SDF-1/CXCR4信号通路促进肿瘤细胞进入淋巴管。Kim等研究发现淋巴管内皮细胞LECs能够通过分泌SDF-1促进表达CXCR4的黑色素瘤细胞淋巴迁移,而Zhuo等经过对54个不同类型肿瘤组织标本的检测,发现其中50个样本的LVD与SDF-1的水平呈阳性相关,并且通过基质胶体内血管生成实验发现SDF-1能够直接促进淋巴管生成,而并不依赖VEGF-C/VEGFR-3信号通路。另外,SDF-1能够促进淋巴管内皮细胞的趋化迁移,在小鼠乳腺癌动物模型中发现SDF-1的抑制剂能够明显减少转移至淋巴结的乳腺癌细胞数量,表明SDF-1/CXCR4反应轴能够直接促进肿瘤淋巴管新生及淋巴结转移。有研究发现SDF-1可诱导内皮细胞表达VEGF,VEGF反过来可上调内皮细胞表面的SDF-1/CXCR4表达,而阻断SDF-1/CXCR4轴可以起到抑制VEGF依赖的血管形成作用,这表明SDF-1和VEGF在促进血管产生过程中有协同作用。同样,Zhuo等发现VEGF-C能够特异性地上调CXCR4的表达,并且VEGF-C/VEGFR-3与SDF-1/CXCR4能够共同促进淋巴管形成,两者亦具有叠加效应。5sdf-1/cxcr4分子靶向治疗作为最主要的淋巴管生成调控因子,针对VEGF-C/VEGFR-3反应轴的靶向治疗研究较多,Karpanen等发现正常组织的淋巴管存活并不仅仅依靠VEGFR-3的功能,这表明肿瘤部位的淋巴管生长能够被选择性的靶向抑制,而不影响正常组织的淋巴管存活。大量的研究通过抗VEGFR-3的小分子抑制剂或单克隆抗体,或利用RNA干扰技术抑制VEGFR-3的表达,发现阻断VEGF-C/VEGFR-3通路能够抑制肿瘤的淋巴管