分子生物学复习资料

第一章绪论分子生物学基本含义：从广义来讲，分子生物学是从分子水平阐明生命现象和生物学规律的一门新兴的边沿学科。它重要对蛋白质及核酸等生物大分子构造和功效以及遗传信息的传递过程进行研究。从狭义来讲，分子生物学的范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，重要研究基因或DNA的复制、转录、体现和调节控制等过程，固然其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的构造与功效的研究。DNA重组技术：DNA重组技术（又称基因工程）是将DNA片段或基因在体外经人工剪接后，按照人们的设计与克隆用载体定向连接起来，转入特定的受体细胞中与载体同时复制并得到体现，产生影响受体细胞的新的遗传性状。信号转导：是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其它细胞功效方面的应答过程。转录因子：是指一群能与基因5′端上游特定序列专一结合，从而确保目的基因以特定强度在特定时间和空间体现的蛋白质分子。RNA的选择性剪切：是指全部基因中的内含子并不是一次全部切去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段选择性剪切部分内含子，生成不同的mRNA及蛋白质分子。基因组：指某种生物单倍体染色体中所含有基因的总数，也就是包含个体生长、发育等一切生命活动所需的全部遗传信息的整套核酸。功效基因组：又称后基因组，是在基因组计划的基础上建立起来的，它重要研究基因及其所编码蛋白质的构造和功效，指导人们充足精确地运用这些基因的产物。生物信息学：是生物科学和信息科学重大交叉的前沿学科，它依靠计算机对所获得数据进行快速高效计算、统计分类以及生物大分子构造功效的预测。构造分子生物学：就是硕士物大分子特定空间构造及构造的运动变化与其生物学功效关系的科学。发展简史：第一，萌芽阶段：DNA是遗传物质的证明。第二，建立和发展阶段：DNA双螺旋模型和中心法则的建立。第三，进一步发展和应用阶段：①重组技术的建立和发展，②基因组研究的发展，③功效基因组研究的发展，④基因体现调控机理的研究。DNA重组技术的应用前景：1、可用于大量生产某些在正常细胞代谢过程中产量很低的多肽。2、DNA重组技术能够变化某些生物的基因组构造。3、DNA重组技术还被用来进行基础研究。两个重要的典型实验验证遗传物质是ＤＮＡ不是蛋白质：肺炎双球菌DNA转化实验，T4噬菌体DNA浸染细菌的实验★★第二章染色体与DNA第一节染色体染色体：是指存在于细胞核中的棒状可染色构造，由染色质构成。染色质是由DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。染色体是一种动态构造，在细胞周期的不同阶段明显不同。真核细胞染色体的特性：染色体位于细胞核的核仁内。在细胞分裂间期，染色体以较细且松散的染色质形式存在，只有在细胞分裂期，才可在光学显微镜下观察到棒状可染色的染色体。在染色体中，DNA与组蛋白和非组蛋白完全融合在一起。原核细胞染色体的特性:染色体位于类似“核”的构造—类核体上；染色体外包裹着稀疏的非组蛋白，不含组蛋白；原核生物中普通只有一条染色体，且大都带有单拷贝基因，只有极少数基因（如rRNA基因)是以多拷贝形式存在的；整个染色体几乎完全由功效基因和调控序列所构成。真核细胞染色体的构成：（2种）蛋白质和DNA；（3种）组蛋白、非组蛋白和DNA。非组蛋白：涉及酶类及细胞分裂有关的某些蛋白。它们可能与DNA的构造、复制及转录等有关。涉及：高速泳动蛋白（HMG，可能与超螺旋构造有关）、DNA结合蛋白（可能是某些与DNA的复制或转录的关的酶或调节物）、A24非组蛋白（肝脏中特有的一组蛋白，与H2A及泛素构造相似，功效不详）。组蛋白：是染色体的构造蛋白，它与DNA构成核小体，是一类小的碱性蛋白。组蛋白的特性：①进化上的极端保守（如H3、H4）；②无组织特异性；③肽链上氨基酸分布的不对称性（赖氨酸、精氨酸含量丰富）；④组蛋白的修饰作用（甲基化、乙酰化、磷酸化）；⑤富含赖氨酸的组蛋白H5（H5的磷酸化可能在染色质的失活过程中起重要作用）。C-值（C-value）:一种生物单倍体基因组DNA的总量。C-值矛盾（C-valueparadox）：基因组大小与机体的遗传复杂性缺少有关性。真核细胞DNA的种类:1、不重复序列：在单倍体基因组中只有一种或几个拷贝的DNA序列。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝。2、中度重复序列:每个基因组中10～104个拷贝。平均长度为300bp，普通是不编码序列，广泛散布在非重复序列之间。可能在基因调控中起重要作用。常有数千个类似序列，各重复数百次，构成一种序列家族。大多数高等真核生物的基因组都有10%~40%的中度重复序列。3、高度重复序列——卫星DNA：只存在于真核生物中，占基因组的10%~60%，由6~100个碱基构成。卫星DNA均位于染色体的着丝粒。染色质：是由许多核小体连成的念珠状构造。核小体：是构成染色质的重复单位，每个核小体由约200（160～250）bp的DNA，和H2A、H2B、H3、H4各2个，以及一种H1构成。其中，H2A，H2B，H3，HDNA多态性：指DNA序列中发生变异而造成的个体间核苷酸序列的差别，重要涉及单核苷酸多态性（SNP）和串联重复序列多态性两类。真核生物基因组的构造特点：1、基因组庞大；2、大量重复序列的存在；3、大部分序列为非编码序列；4、转录产物为单顺反子；5、真核基因是断裂基因；6、真核基因存在大量的顺式作用元件；7、DNA存在多态性；8、含有端粒构造。真核生物基因组庞大的因素：①存在大量的重复序列②大部分为非编码序列③真核生物的基由于断裂基因，含有内含子构造原核生物基因组的特点1、构造简洁：其DNA分子绝大多数用于编码蛋白质，并且编码序列是持续的；2、存在转录单元：功效上亲密有关的基因构成操纵子或高度集中，并且可被一起转录；3、有重叠基因，同一段DNA序列能携带两种不同蛋白质的遗传信息。ＤＮＡ的压缩环节和比率：ＤＮＡ－核小体－螺线管－超螺线管－染色体。对应压缩比为：７ｘ６ｘ４０ｘ５＝８４００第二节DNA的构造DNA的一级构造：是指4种核苷酸的排列次序，表达了该DNA分子的化学构成。又由于4种核苷酸的差别仅仅是碱基的不同，因此又是指碱基的排列次序。DNA一级构造的基本特点：1、由两条互相平行的脱氧核苷酸链盘绕而成；2、两条主链的脱氧核糖和磷酸由3’,5’磷酸二酯键交互连接而成，排在外侧，构成基本骨架；碱基位于内侧；3、两条链上的碱基通过氢键结合，形成碱基对，碱基必须以A-T、C-G配对。DNA的二级构造：是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋构造。DNA的高级构造：是指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间构造。超螺旋的生物学意义：①超螺旋可形成高度致密状态，从而得以容纳于有限的空间内。②活体中，DNA的构象是动态的。B-DNA是一种稳定构造，引入负超螺旋可提高其能量水平，影响DNA构造变化。如有助于在特定区域的构造转化、使DNA双链分开等。DNA拓扑异构酶：1、功效：催化DNA分子拓扑异构体之间的互相转化。2、作用机制：切开磷酸二酯键，在主链上造成切口，通过变化连接数（L）来变化超螺旋状态。3、分类：I型拓扑异构酶：每次切开一股链。II型拓扑异构酶：每次切开双股链。既可消除负超螺旋，又可消除正超螺旋。需要ATP，使分子L值每次变化±2。正超螺旋（positivesupercoil）：由于双链紧缠而引发的超螺旋。负超螺旋（negaivesupercoil）：由于双链松缠而引发的超螺旋。两种超螺旋的自由能均高于松弛状态。天然原核生物DNA都呈负超螺旋；③在体外可形成正超螺旋，如加入溴乙锭，可引入正超螺旋。第三节DNA的复制半保存复制：每个子代分子的一条链来自亲代DNA,另一条则是新合成的，这种复制方式称为DNA的半保存复制。对一种生物体而言，复制的起点是固定的，复制叉移动的方向和速度以双向等速为主。半不持续复制：DNA在复制时，其中一条新生链是持续合成的，而另一条新生链的合成是不持续，称为DNA合成的半不持续复制。前导链：随着亲本双链体的解开而持续进行复制的链，称为前导链。后随链：一段亲本DNA单链首先暴露出来，然后以与复制叉移动相反的方向、按照5’→3冈崎片段：后随链不持续合成形成的短DNA片段。复制叉：正在进行复制的复制起点呈现叉子的形式，称为复制叉。复制眼：DNA复制的部分看上去象一只眼睛，称为复制眼。复制子：生物体的复制单位称为复制子。DNA复制的几个方式：线性DNA双链的复制（1）将线性DNA分子转变为环状或多聚分子（末端简并性是前提条件，如T4噬菌体）；（2）DNA末端发夹构造的形成，如（草履虫的线性线粒体）；（3）在某种蛋白的介入下，在真正的末端起始复制，（如Φ29噬菌体和腺病毒DNA）；环状DNA双链（1）θ型，如大肠杆菌质粒DNA的复制；（2）滚环型复制如：ΦX174在原点割切，共价延伸，切下被替代的单链；（3）D-环形，如动物线粒体DNA的复制。实验验证DNA半保存复制的办法：原理，母链中的全部置换为N15，然后让E.coli在仅含有N14的培养基上进行复制。具体环节：1、将大肠杆菌在仅含有15N做氮源的培养基上培养得到15N-DNA，同时在含有14N的培养基中培养同种的大肠杆菌作为对照，取少量大肠杆菌细胞破碎在采用氯化铯密度梯度离心标记两种不同的DNA形成的位置区带2、将双链都是15N标记的DNA的大肠杆菌转移到仅含有14N做氮源的培养基中培养一代，取出培养的大肠杆菌破碎进行离心，可得到离心区带在14N和15N的中间部位原核生物DNA的复制DNA双螺旋的解旋在拓扑异构酶I的作用下解开负超螺旋在解链酶共同作用，在复制起点处解开双链局部解开双链，就必须有单链结合蛋白(SSB)来稳定解开的单链，以确保核苷酸局部不会恢复成双链接着由引发酶等构成的引发体作用于两条单链DNA上。DNA解旋过程中需要的酶有：拓扑异构酶Ⅰ，解链酶，单链结合蛋白（SSB）DNA解旋过程中需要的多个酶：a、DNA解链酶，大部分解链酶沿后随链模板的5´→3´方向并随着复制叉的迈进而移动；Rep蛋白是沿前导链模板的3´→5´方向移动。b、单链结合蛋白（SSB），作用是确保被解链酶解开的单链在复制完毕前保持单链构造。其并没有解链作用c、DNA拓扑异构酶，在DNA复制过程中形成正超螺旋，拓扑异构酶能够消除解链造成正超螺旋的堆积，消除妨碍解链进行的压力，使复制继续进行。DNA复制的引发先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物由DNA聚合酶从RNA引物3，端开始合成新的DNA链。后随链的引发过程由引发体来完毕，引发体由6种蛋白质n、n‘、n‘‘、DnaB、C和I共同构成，6种蛋白质合在一起形成引发前体，引发前体与引发酶进一步组装成引发体才干发挥其功效。引发酶是dnaG基因的产物，是在特定条件下发挥作用的RNA聚合酶，仅用于合成DNA复制所需的一小段RNA。DNA的引发过程中需要的酶：引发酶，DNA聚合酶，RnaseⅠ，DNA连接酶DNA复制的终止：当复制叉碰到约22个碱基的重复性终止子序列（Ter)时，Tus-Ter复合物能使DnaB不再将DNA解链，阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉达成后停止复制。原核生物复制的特点：①只有一种复制原点，而真核生物能够有多个②在原核生物的复制原点处含有串联重复序列，其中富含A-T碱基原核生物DNA聚合酶的比较性质聚合酶I聚合酶II聚合酶III3’-5’＋＋＋5’-3’＋——新生链合成——＋生物学活性10.0515DNA聚合酶Ⅰ含有两个区域，一种为Klenow片段同时含有DNA聚合酶的活性和3’-5’DNA聚合酶II：具DNA聚合酶活性，但活力很低；具3’DNA聚合酶III：具DNA聚合酶活性，活力较强；具3’真核生物DNA的复制真核生物DNA聚合酶的比较（有：“—”，无：“＋”）性质DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亚基数4122～3≥1在细胞内分布核内核内线粒体核内核内功效DNA引物合成损伤修复线粒体DNA复制重要DNA复制酶复制修复3’-5’外切无无有有有5’-3’外切无无无无无真核生物DNA的复制的特点：1、真核生物每条染色体上能够有多处复制起始点。2、真核生物DNA的复制普通为双向移动。3、真核生物的染色体在全部完毕复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始。自主复制序列（ARS）特点：真核生物DNA复制的起点，含有一种A区，该区含有11个A-T碱基对的保守序列。真核生物DNA复制的起始需要起始点识别复合物（originrecognitioncomplex,ORC)结合于ARS，ORC是由6种蛋白质构成的启动复合物。复制子工作的频率：1、在任意时刻，普通只有少数（<15%）复制子工作。2、只有一部分用于起始复制，另有一部分有时使用。复制子的长度不是固定不变的真核生物DNA聚合酶的分类和功效：DNA聚合酶α，重要功效是引物的合成，且具体有引发和延伸链的双重功效；NDA聚合酶β，活性水平稳定，重要在DNA损伤的修复中起作用属于高忠实性修复酶；DNA聚合酶δ是重要负责DNA复制的酶参加前导链和后随链的合成；DNA聚合酶ε与后随链的合成有关，在DNA合成过程中核苷酸切除以及碱基的切除修复中起重要作用，另外它在细胞的重组过程中起作用；DNA聚合酶γ在线粒体DNA复制中起作用第四节DNA的修复错配修复：又称甲基指导的错配修复，是按模板的遗传信息来修复错配碱基的，修复时先要分辨模板链和复制链。这是通过碱基的甲基化来实现的。切除修复有两种：1、碱基切除修复。（切除碱基）2、核苷酸切除修复。（破坏磷酸糖苷键）AP位点：在DNA修复过程中糖苷水解酶水解结合在五碳糖上的碱基在DNA链上形成的去嘌呤或去嘧啶的位点称为AP位点。重组修复：机体细胞对在起始复制潮流未修复的DNA损伤部位能够先复制再修复。原理：先从同源DNA母链上将对应核苷酸序列片段移至子链缺口，然后再用新合成的序列补上母链缺口。DNA的直接修复：在DNA光解酶的作用下把在光下或经紫外线照射形成的环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体得过程。SOS反映：是细胞DNA受到损伤或复制系统受到克制的紧急状况下，细胞为求生存而产生的一种应急方法。重要涉及：（1）DNA的修复；（2）产生变异。第五节DNA的转座DNA的转座：又称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。转座子：存在与染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位。转座子的分类：1、插入序列(IS因子)：插入序列是最简朴的转座子，不含有任何宿主基因，是细菌染色体和质粒DNA的正常构成部分。2、复合型转座子：含有IS模块，其它基因位于中央区；是一类带有某些抗药性基因或其它宿主基因的转座子，其两翼往往是两个相似或高度同源的IS序列。3、TnA家族转座子：复合转座子，较大（～5kb），无IS类型元件。IS因子的普通构造：a、长度较小(约1kb)；b、含有编码本身移动的酶--转座酶（transposase）；c、含一对反向末端重复序列（invertedterminalrepeats）；d、在靶位点产生一正向重复序列。转座的类型：1复制型转座：转入新位点的是原先元件的拷贝，即转座子作为可移动的元件被复制，2、非复制型转座：座子作为一种物理实体从供体的一种位点转移到受体的一种位点；这种方式会在供体分子处留下一种裂口。转座子的遗传效应：1、引发插入突变。2、插入位点出现新基因。3、引发染色体畸变转座增进重排。4、引发生物进化。真核生物的转座子：1、玉米中的控制因子没有固定的染色体定位。2、果蝇中的P转座子自主性因子：含有自主剪接和转座能力，可持续移动，造成的成果不稳定。非自主性因子：不能自发转座，只有在基因组中存在同一家族的自主元件时，才干发生转座而变得不稳定。★★★第三章生物信息传递（上）——从DNA到RNA基因的体现：涉及转录和翻译两个阶段，其中转录是基因体现的核心环节，翻译是基因体现的最后目的。转录：以DNA单链为模板，NTP为原料，在依赖DNA的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。模板链：或反义链，作为模板，按碱基互补配对原则转录成RNA的DNA链。编码链：或故意义链，与模板链互补的非模板链，其编码区的碱基序列与转录产物mRNA的序列相似（仅T、U交换）。第一节RNA转录的基本过程RNA转录的基本过程：模板识别，转录起始，通过启动子，转录延伸，转录终止。模板识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链互相作用并与之相结合的过程。转录的起始：全酶-启动子形成闭合二重复合体；闭合复合体转变为开放复合体；整合进最初两个核苷酸，形成一种磷酸二酯键，形成三重复合体。通过启动子：在酶不需要移动时，即可加入9个核苷酸，但在加入核苷酸过程中，随时可能释放RNA；起始成功后，释放出σ因子。真核生物有三种RNA聚合酶，分别催化不同RNA的合成，每种酶的作用均需某些蛋白辅助因子的参加，将这些因子称为转录因子。转录延伸：RNA聚合酶释放σ因子离启动动子后，核心酶沿模板DNA链移动并使新生RNA链不停伸长的过程。转录的终止：RNA聚合酶和RNA链从模板上释放，DNA恢复成双链状态。转录因子TFs：真核生物转录起始过程中，除RNA聚合酶之外的其它辅助因子统称为转录因子。TFs协助RNA聚合酶识别启动子。TFs(转录因子）必须先与DNA形成复合物，协助RNA聚合酶定位到转录起始的位点。RNA聚合酶和转录因子在DNA上的定位形成前起始复合物，由于转录因子的作用复合物由封闭型转换成开放型。第二节转录机器的重要成分RNA聚合酶：RNA聚合酶重要以双链DNA为模板；RNA聚合酶是转录过程中最核心的酶；每个细胞中约有7000个RNA聚合酶；任何时候大概2000~2500个核心酶执行转录功效。原核生物RNA聚合酶：由2个α亚基、一种β亚基、一种β′亚基和一种ω亚基构成核心酶，加上一种σ亚基构成聚合酶全酶。α亚基可能与核心酶的组装及启动子识别有关。β亚基和β′亚基共同形成RNA合成的活性中心。σ亚基存在多个σ因子，σ因子负责模板链的选择和转录的起始。σ因子识别起始点，延伸过程只需要核心酶的催化真核生物RNA聚合酶：分三类1、RNA聚合酶I：转录产物是45SrRNA，经介绍修饰后生成除了5SrRNA外的多个rRNA。2、RNA聚合酶II：在核内转录生成hnRNA，经剪接加工后生成成熟mRNA被运输到细胞质中作为蛋白质合成的模板。3、RNA聚合酶III：转录产物是tRNA，5SrRNA，snRNA；其中snRNA参加RNA的剪接。酶细胞内定位转录产物相对活性对α-鹅膏蕈碱的敏感程度RNA聚合酶I核仁rRNA50％～70％不敏感RNA聚合酶II核质hnRNA20％～40％敏感RNA聚合酶III核质tRNA约10％存在物种特异性转录复合物：分为闭合二重复合体、开放二重复合体、三重复合体、转录延伸复合物。DNA转录循环理论：1、NTP弥补了开放的底物位点，并在活性位点形成磷脂键。2、处在聚合酶中心的核酸发生位移，其是连接区α螺旋构造由笔直变为弯曲再恢复成为笔直状态，为下一轮RNA的合成留出了空的底物位点。课本P74第三节启动子与转录的起始RNA聚合酶与启动子的互相作用重要涉及：启动子的识别，酶与启动子的结合，σ因子的结合与解离。启动子：是一段位于构造基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA精确地结合并含有转录起始的特异性。转录单元：是一段从启动子开始到终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起始位点开始沿着模板迈进，直到终止子为止，转录出一条RNA链。转录起始位点：是指与新生RNA链第一种核苷酸相对应DNA链上的碱基，研究证明普通为一种嘌呤。★原核生物启动子特性：①起点普通是一种嘌呤。②起点上游10bp处，有一约6bp的保守区域，称为-10区（也叫PribnowBox），共有序列为：TATAA。③起点上游35bp处，有一约6bp的保守区，称为-35区，共有序列为：TTGACA。④90%的启动子中，-10与-35区的距离在16-19bp之间；两个保守区之间的序列并不重要，但距离很核心。★真核生物基因中启动子特性：①TATAbox：位于RNA聚合酶II转录起点上游约-35~-25bp处的共同序列TATAAA，绝大多数状况下全部是A-T碱基对，只有少数含有G-C。②CAATbox：在起点上游-78~-70bp处尚有另一段共有序列CCAAT，称为CAAT区。③GCbox：在起点上游-110~-80bp处有一段富含GC碱基对的序列（GCCACACCC或GGGCGGG），称为GC区。④增强子：能强化转录起始频率的DNA序列。*(记得补充第八章真核生物转录的调控处)真核生物启动子对转录的影响：①TATAbox是核心启动子，控制转录的精确开始，②CAATbox上游启动子控制转录起始的频率增强子的特点：（1）远距离作用；（2）无方向性；（3）顺式调节；（4）无物种和基因的特异性；（5）含有组织特异性；（6）有相位性；（7）有的增强子可对外部产生信号。RNA聚合酶对启动子的识别是通过与碱基上的氢键供体和受体在一定距离内互补，形成氢键而实现的启动子突变:下降突变：减少其构造基因转录水平的启动子突变，称为下降突变。上升突变：提高其构造基因转录水平的启动子突变，称为上升突变。第四节原核生物与真核生物mRNA特性的比较原核生物mRNA的特性：a、半衰期短；b、许多mRNA以多顺反子的形式存在；c、无帽子和尾巴构造SD序列：原核生物起始密码AUG上游7~12个核苷酸处的6个核苷酸的保守序列，被认为在核糖体-mRNA结合过程中起作用。真核生物mRNA的特性：a、mRNA的5’端存在“帽子”构造；b、3操纵子:一组相邻或互相重叠的基因,在基因转录时协同作用，这样一组基因称为操纵子。基因的分子生物学定义：产生一条多肽链或功效RNA所必需的全部核苷酸序列。帽子构造的作用:1、提高mRNA的活性及稳定性；2、可能是蛋白质合成起始信号的一部分。第五节终止与抗终止不依赖于ρ因子的终止合成的RNA尾部的序列（终止子）的特性：1、二重对称的序列形成发卡构造；在发卡构造的茎基部富含G-C对；发卡构造可减缓或暂停合成。2、尾部有约4~8个持续的U；持续的A-U对使杂交链更容易分离。依赖于ρ因子的终止ρ因子是由rho基因编码，分子量为55KDa的蛋白质，其活性形式为六聚体，在离体条件下有两种活性，一种是解螺旋酶的活性，另一种是NTP酶的活性。ρ因子可结合于自由RNA链，并沿RNA链移动。结合在正在合成的RNA链的5’端，运用水解NTP释放的能量，从5’端向3’端移动，当RNA聚合酶移动到终止子而暂停时，ρ因子达成RNA的3第六节内含子的剪切、编辑及化学修释不持续基因：真核生物基因除了与mRNA相对应的编码序列外，还含有某些不编码序列插在编码序列之间，这些不编码序列在加工为成熟的mRNA时被去除，这样的基因称为不持续基因或断裂基因。外显子：基因中与mRNA一致的序列，即编码序列。一种基因总是以外显子为起点和终点。内含子：基因中编码序列之间的介入序列，在原初转录物加工为mRNA时被去除，即非编码序列。真核生物RNA中的内含子构造的特点：①GU表达供体衔接点的5′端，AG代表接纳体衔接点的3′端，把这种保守序列模式成为GU-AG法则。②5′端有一保守序列（5′-GUPuAGU-3′）。③3′端剪接位点AG的附近有一段富含嘧啶的区域，含有10~20个嘧啶核苷酸。④3′端上游18~50个核苷酸处，存在一种序列为Py80NPy87Pu75APy96的保守区。剪接体的组装和剪接过程：①、U1结合在5’剪切位点。②、U2AF结合在多嘧啶区。③、U2结合在分支点，形成剪接前体进一步与U4、U5、U6三聚体结合，形成60S剪接体。④、U1释放，U5从内含子区移到外显子区，U6结合在5’剪切位点。⑤、U4释放，U6/U2催化5’剪切，U5结合在3’剪切位点。⑥、U2/U5/U6催化构成性剪接：在高等真核生物中，内含子普通是有序或构成性地从mRNA前体中被剪接，这种剪接方式称为构成性剪接。变位剪接：又叫选择性剪接，指在剪接过程中能够有选择性地越过某些外显子或某个剪接位点进行变位剪接，产生出不同mRNA，这种剪接方式称为变位剪接。自我剪切的RNA：①、I类内含子：剪接重要是转脂反映，即剪接反映事实上是发生了两次磷酸二脂键的转移。②、Ⅱ类内含子：剪接重要存在于真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中。RNA的编辑：指某些RNA，特别是在mRNA中插入、删除或取代某些核苷酸残基，造成DNA所编码遗传信息的变化，从而翻译出多个氨基酸序列不同的蛋白质。成果使成熟mRNA的核苷酸序列不同于前体，也不同于DNA模板，使遗传信息在mRNA水平上发生变化。介导RNA编辑的机制有两种：a、脱氨基作用（载脂蛋白mRNA的编辑）b、引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除（尿苷酸的缺失和添加）指导RNA：指导RNA编辑的小分子RNA，又称向导RNA。长度大概是60~80个核苷酸，中间有一段与被编辑mRNA相称程度互补的序列。指导RNA上存在某些未能配对的腺嘌呤，形成缺口，为插入尿嘧啶提供了模板。RNA编辑的生物学意义：（1）校正作用；（2）调控翻译；（3）扩充遗传信息。RNA的化学修饰含有位点特异性。途径涉及：甲基化，去氨基化，硫代，碱基的同分异构化，二价键的饱和化，核苷酸的替代。核酶：是指一类含有催化功效的RNA分子，通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断基因的体现。核酶的分类：根据催化功效可分为：剪切型核酶，剪接型核酶。核酶的成果特点：核酶的二级成果为锤头构造。由三个茎构成，茎区是由互补碱基构成的局部双链构造，包围着一种由11~13个保守核苷酸构成的催化之心。核酶剪切普通发生在H位点。★★★第四章生物信息的传递（下）——从mRNA到蛋白质蛋白质的生物合成环节：(1)翻译的起始：核糖体与mRNA结合并与氨酰-tRNA生成起始复合物。(2)肽链的延伸：由于核糖体沿mRNA5’端向3’端移动，开始了从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度最快的阶段。(3)肽链的终止及释放：核糖体从mRNA上解离，准备新一轮合成反映。核糖体是蛋白质合成的场合。mRNA是蛋白质合成的模板。转移RNA是模板与氨基酸之间的接合体。在合成的各个阶段有许多蛋白质、酶和其它生物大分子参加。翻译：是指将mRNA链上的核苷酸从一种特定的起始位点开始，按每3个核苷酸代表一种氨基酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。第一节遗传密码——三联子遗传密码的破译：1954，Gamov提出遗传密码的问题,43=64；1961，Brenner&Crick：加入或减少1个或2个核苷酸即可造成形成不正常的蛋白质；但加入或减少3个经常对蛋白质活性影响不大。1961，Nirenberg：人工合成多聚尿嘧啶核苷酸指导合成的多肽只含一种氨基酸--苯丙氨酸；1964，Nirenberg：tRNA结正当。特异的氨酰-tRNA可与核糖体-mRNA结合。mRNA可短至3个碱基。密码：也叫三联子密码，mRNA上代表一种氨基酸或蛋白质合成及终止信号的核苷酸三联体。★遗传密码的特点：1、密码的持续性。2、密码的简并性。3、密码的通用性与特殊性。4、密码子与反密码子的互相作用。密码子与反密码子的互相作用机制：摇晃假说，1）mRNA上密码子第一、二碱基与tRNA上反密码子对应碱基形成强配对；密码专一性重要是由于这两个碱基的作用。2）反密码子的第一种碱基决定一种tRNA能够解读密码子的数目。3）当一种氨基酸的几个密码子中，有头2个碱基中任一种是不同的，则必须有不同的tRNA。阅读框：读取由一系列三联体构成序列的三种可能方式之一。可译框架：又叫可读框，指由起始密码子开始，到终止密码子结束的核苷酸序列。简并：一种氨基酸由多个密码子编码的现象，称为简并。同义密码子：对应同一种氨基酸的密码子称为同义密码子。★起始密码子：密码子AUG与N-甲酰甲硫氨酸-tRNA（tRNAfMet）结合，在原核生物中启动蛋白质结合，因此AUG被称为起始密码子。★终止密码子：UAA、UAG、UGA；终止密码子不编码任何氨基酸，也称为无义密码子。第二节tRNAtRNA的共同特性：1、存在通过修饰的特殊碱基。2、3'端均为CCA-OH。★tRNA的构造：①二级构造：三叶草形。tRNA上的手臂：（1）受体臂：链两端碱基序列互补形成的杆状构造；3’端有未配对的3～4个碱基；3’端的CCA，最后一种碱基2‘自由羟基可被氨酰化。（2）TψC臂（环）其中ψ表达拟尿嘧啶，是tRNA分子所拥有的不常见核苷酸。（3）反密码臂（环）位于套索中央有三联反密码子。（4）D臂（环）含有二氢尿嘧啶。（5）多出臂（环）。②tRNA三级构造：tRNA折叠为L形，与氨基酸结合的受体臂与反密码环互相远离，分别位于两端；不同的tRNA形状大致相似又有所差别。★tRNA的功效：tRNA在蛋白质合成中为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，为精确无误地将所需氨基酸运输到核糖体上提供了运输载体，它又被称为第二遗传密码。每个tRNA与一特定的氨基酸特异共价结合生成有蛋白质合成活性的AA-tRNA（氨酰-tRNA）；含有一种三核苷酸序列的反密码子，与mRNA上代表该氨基酸的密码子互相识别并配对。密码子的识别仅决定于反密码子，而与氨基酸无关。tRNA的种类：1、起始tRNA和延伸tRNA：特异地识别mRNA模板上起始密码子的tRNA叫起始tRNA，其它tRNA统称为延伸tRNA。2、同工tRNA：代表相似氨基酸的不同tRNA。3、校正tRNA：通过反密码子区的变化把对的的氨基酸加到多肽链上的tRNA。无义突变：指某个核苷酸的变化使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子，使蛋白质的合成提前终止，合成无功效或无意义的多肽，这种突变称为无义突变。错义突变：指某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码，这种突变称为错义突变。氨酰tRNA合成酶：是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶。功效是：既要识别tRNA，又要能识别氨基酸，它对两者都含有高度的专一性。第三节核糖体★核糖体的构造：1、核糖体由大小两个亚基构成，存在形式为核糖体、核糖体亚基、多核糖体。2、核糖体蛋白构成：核糖体上有多个活性中心，每个中心都由一组特殊的核糖体蛋白质构成。3、核糖体RNA（rRNA）：5SrRNA，16SrRNA，23SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SrRNA。4、核糖体有3个tRNA结合位点：A位点：氨酰tRNA结合位点；P位点：肽酰tRNA结合位点；E位点：延伸过程中多肽链转移到肽酰tRNA上释放tRNA的位点。★核糖体的功效：1、核糖体小亚基负责对模板mRNA进行序列特异性识别，如起始部分的识别、密码子与反密码子的互相作用等，mRNA的结合位点也在小亚基上。2、大亚基负责携带AA及tRNA的功效，涉及肽键的形成、AA-tRNA与肽酰-tRNA的结合等。核糖体上的活性位点：mRNA结合部位、结合或接受AA-tRNA部位（A位），结合或接受肽酰-tRNA的部位（P位），肽基转移部位及形成肽键的部位（转肽酶中心）。★第四节蛋白质合成的生物学机制氨基酸的活化：氨基酸与tRNA结合形成氨酰-tRNA，反映在细胞质进行。tRNA末端最后一种碱基五碳糖3’起始因子：蛋白质合成起始阶段特异地与小亚基结合的蛋白质。★原核生物蛋白质翻译的起始：第一步，30S小亚基首先与翻译起始因子IF-l，IF-3结合，通过SD序列与mRNA模板相结合。第二步，在IF-2和GTP的协助下，fMet-tRNAfMet进入小亚基的P位，tRNA上的反密码子与mRNA上的起始密码子配对。第三步，带有tRNA、mRNA及3个翻译起始因子的小亚基复合物与50S大亚基结合，GTP水解，释放翻译起始因子。★真核生物蛋白质翻译的起始：第一步，Met－tRNAiMet与40S小亚基相结合；接着核糖体上专一位点识别mRNA的帽子，使mRNA与核糖体结合。第二步，帽子在mRNA与40S亚基结合过程中起稳定作用。带帽子的mRNA5‘端与18SrRNA的3’端序列之间存在碱基配对型互相作用。第三步，除了识别帽子构造以外，40S小亚基还能识别mRNA上的起始密码子AUG。真核生物与原核生物翻译起始的异同点：真核生物翻译起始机制与原核生物基本相似，其差别是核糖体较大、起始因子较多、mRNA有m7GpppNp帽子构造、Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5’端的帽子和3’端的多聚A都参加形成翻译起始复合物。肽链的延伸：1、后续AA-tRNA与核糖体结合。2、肽键的形成。3、核糖体的移位。延伸因子：是指在蛋白质合成中，每向肽链中加入一种氨基酸时，与核糖体周期性结合的蛋白质分子。EF-Tu：协助氨酰-tRNA进入A位点；EF-Ts：使EF-Tu恢复活性；EF-G：参加核糖体移位。肽链的终止：肽链在延伸过程中，当终止密码子出现在核糖体的A位时，释放因子能识别终止密码子并与之结合，水解P位上多肽链与tRNA之间的酯键。新生的肽链和tRNA从核糖体上释放，核糖体解体，蛋白质合成结束。蛋白质前体的加工：1．N端fMet或Met的切除：细菌蛋白质N端的甲酰基能被脱甲酰化酶水解，原核生物和真核生物N端的甲硫氨酸在多肽链合成完毕之前被切除。2．二硫键的形成：二硫键是蛋白质合成后通过两个半胱氨酸的氧化作用生成的。3．特定氨基酸的修饰：氨基酸侧链的修饰涉及磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羟基化和羧基化等。4、切除新生链中非功效片段。蛋白质的折叠：是指从多肽氨基酸序列形成含有对的三维空间构造的蛋白质。分子伴侣：是介导新生肽链对的组装，成为成熟蛋白质，而本身却不是最后功效蛋白构成成分之一的蛋白质分子。热休克蛋白：是一类应激反映性蛋白，涉及HSP70、HSP40和GrpE家族，广泛存在于原核和真核细胞中。三者协同作用，促使某些能自发折叠的蛋白折叠整天然构象。伴侣素：涉及HSP60和HSP10，重要为非自发性折叠蛋白提供能折叠整天然构象的环境。蛋白质合成的克制剂：（克制途径）制止mRNA与核糖体结合（氯霉素）；制止AA-tRNA与核糖体结合（四环素）；干扰AA-tRNA与核糖体产生错读（链霉素）；作为竞争性克制剂克制蛋白质合成（白喉毒素与EF2结合，克制肽链的移位）。第五节蛋白质的转运机制蛋白转运：指蛋白插入或穿过膜的过程。翻译后转运机制：若蛋白质是在胞质中的核糖体上合成、释放后再过膜转移，这种蛋白质过膜方式称为翻译后转运。翻译-转运同时机制：若在与内质网结合的核糖体上合成的蛋白质前体，其合成和过膜转移是同时发生的，这种蛋白质的过膜方式称为翻译-转运同时机制。两种转运的共同特性:N端序列在移位过程中被切除；2、N端序列构成一成熟蛋白质没有的前导序列，含有前导序列的蛋白称为前体蛋白。前导肽的特性:1、富含带正电荷的碱性氨基酸，且分布在不带电荷的氨基酸之间；2、缺少带负电荷的酸性氨基酸；3、羟基氨基酸含量较高；4、有形成两亲（现有亲水又有疏水部分）α螺旋构造的能力。翻译-转运同时机制蛋白质的合成环节：核糖体在自由mRNA上起始合成蛋白质；信号识别颗粒（signalrecognitionparticle,SRP）结合于前导序列，翻译暂停；SRP与SRP受体结合，核糖体附着在膜上；翻译继续；前导序列进入膜；蛋白穿过膜，前导序列被切除；翻译继续；蛋白通过膜被分泌；核糖体从mRNA上释放。翻译后转运蛋白质由有利核糖体合成，去向：线粒体、叶绿体等细胞器，细胞质蛋白，细胞核蛋白第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术第一节重组DNA技术回想上世纪分子生物学研究获得的三大成就：第一，在20世纪40年代拟定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋构造模型和半保存复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与体现机制。重组DNA技术：是应用酶学办法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适宜的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。重组DNA技术使用的工具酶：1、限制性内切酶：一类能识别和切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。分为：I型、II型、Ⅲ型。其中类型I：识别的DNA序列长约十几个bp；酶切位点在距识别位点1kb左右处随机切割，非特异性；复合酶，无使用价值。类型II：识别位点和酶切位点一致，具特异性。单体酶，性质稳定，Mg2+为辅助因子。现在已分离了数百种。2、DNA连接酶：将两段DNA片段连接起来的酶称为DNA连接酶。类型Ⅲ：酶切位点在识别位点下游24-26bp处，非特异性。限制性内切酶II型的基本特性：(1)识别dsDNA分子中4～8bp的特定序列；(2)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧；(3)识别切割序列呈典型的旋转对称型回文构造。限制性内切酶切割双链DNA分子可产生粘性末端（切口上两条链上的碱基不互补配对）和平末端（切口上两条链上的碱基都互补配对），重组DNA技术中运用粘性末端。克隆用载体：是指含有自我复制能力的DNA分子。常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。克隆用载体的选择条件：1、含有复制原点，能够自我复制。2、含有适合的酶切位点，且不在原点。3、含有筛选指标：对抗菌素的抗性和基因产物的显色反映。载体的功效：运输外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或体现提供必要的条件。第二节DNA基本操作技术核酸的凝胶电泳基本原理：带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反映活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型的差别，以及所带电荷的不同，能够通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。种类：(1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳。(2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶。(3)两种办法比较：分离效果和分离范畴;操作难易电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比。影响因素：与分子的摩擦系数成反比，摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉未加热到溶点后凝固，便会形成良好的介质，其密度由琼脂糖的浓度所决定。特点：分辨能力低，但应用范畴广，合用于较大分子的分析。适于分离200bp~50kb的DNA片段。操作简便。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED(四甲基乙二胺）的作用下聚合而成。聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成立体的不溶于水的凝胶。特点：分辨能力高，但应用范畴小，合用于较小分子的分析。适于分离5bp~500bp的DNA片段。操作复杂。用途：琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶惯用于小分子核酸分析。凝胶电泳的普通程序制胶点样电泳染色观察细菌转化：是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA而造成性状特性发生遗传变化的生命过程。提供转化的DNA菌株叫供体菌株，接受转化的DNA菌株叫受体菌株。现在惯用的转化办法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。基因克隆的操作：1、从复杂的生物有机体基因组中，通过酶切消化或PCR扩增等环节，分离出带有目的基因的DNA片段；2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并含有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；3、感受态细胞的制备—氯化钙法：第一次摇菌第二次摇菌离心收集细菌0.1MCaCl2重悬细胞,冰浴30min离心、重悬重复一次4、转化：感受态细胞与连接产物轻轻混匀,冰浴30分钟，42℃水浴热激60–90秒，快速冰浴2分钟加液体LB5、筛选：①根据重组载体的表型；②根据DNA限制酶的酶谱分析：③PCR反映聚合酶链式反映：即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的办法。PCR特异性：即所扩增片段是由两个人工合成的引物序列决定的。PCR反映原理：①变性：双链DNA分子加热分离成两条单链DNA分子的过程变性温度：是指双链DNA分子50％发生变性时的温度，普通为94∽95℃②退火：两引物分别与两条DNA的两侧序列特异性互补，形成双链的过程称为退火。退火温度：普通在50∽65℃③延伸：在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，以4种脱氧核苷三磷酸（dNTP)为底物,在引物的诱导下，按5′→3′方向复制互补DNA的过程。延伸温度：普通为70∽75℃，此时DNAPCR反映体系的成分：模板DNA，耐热的DNA聚合酶，PCR反映的缓冲液（Mg2+，Tris•Cl），引物，dNTP。循环参数：温度循环参数：变性，变性温度，退火，退火温度，延伸，延伸温度时间参数：变性时间：决定于DNA的复杂性，普通选用94℃1min,因过长的高温时间，会减少DNA退火时间：普通状况下取30s~1min，由于引物比较短。延伸时间：根据扩增片段的长度而定，普通在1kb以内的片段需延伸1min,更长的片段需对应延长时间。引物应满足的条件：1、引物长度在15∽30bp之间，引物的退火温度Tm=4(G+C)+2(A+T)。2、碱基随机分布：避免一连串相似碱基，引物本身不应存在互补序列，两条引物间也不应有互补性，特别是3′端。3、G+C含量：G+C含量普通为40％∽60％。4、引物3′端碱基的特异性。PCR技术的特点：第一，特异性强；第二，效率高；第三，敏捷度高。实时定量PCR技术：指运用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，运用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而测定终端产物的丰度。特异性的荧光探针：是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现实时、定量检测。TaqMan探针：是一小段被设计成能够与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（普通为5~50bp），并且该单链DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。Ct值：指PCR扩增过程中，扩增产物荧光强度初次超出设定阈值时，PCR反映所需的循环数。Ct值与模板起始浓度的关系：1、模板起始浓度越高，Ct值越小。2、Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系。基因组DNA文库构建：是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范畴的DNA片段，再与适宜的载体在体外重组并转化对应的宿主细胞获得的全部阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。基因组DNA文库的类型：根据所选用的载体能够分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。一种抱负的基因组DNA文库应含有下列条件：1、重组克隆的总数不适宜过大，以减轻筛选工作的压力。2、载体的装载量最佳不不大于基因的长度，避免基因被分隔克隆。3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序。4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下。5、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。基因组DNA文库构建的程序：①载体DNA的制备；②基因组DNA的提取；③基因组DNA的部分酶切、分离与回收；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑选和保存。第三节RNA基本操作技术总RNA的提取（书P.172）；mRNA的纯化的原理及重要操作环节（书P.173）；cDNA的合成的原理及重要操作环节（书P.174）cDNA文库：将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，与载体连接，然后转化宿主细胞，得到含全部体现基因的种群，称为cDNA文库。cDNA文库含有组织细胞特异性。构建cDNA文库的重要操作（书P.176）基因文库的筛选：构建cDNA文库的重要操作1、核酸杂交法2、PCR筛选法①设计特异性引物；②将文库保存在多孔培养板上，对每个孔进行PCR扩增；③对阳性孔进行稀释至次级孔，再对每个孔进行PCR扩增，直至鉴定出与目的基因对应的单克隆。3、免疫筛选法合用范畴：体现文库；用某个基因产物的特异性抗体对重组克隆进行筛选。第四节SNP理论及应用SNP：中文翻译为单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引发的多态性。根据位置不同可分为：基因编码区SNP（cSNP），基因调控区SNP（pSNP）和基因间随机非编码区SNP（rSNP）。cSNP又可分为同义cSNP和非同义cSNP。单倍型：位于染色体上某一区域的一组有关联的SNP等位位点被称作单倍型。基因分型：是指运用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率研究。检测SNP惯用的办法及原理：1、基因芯片技术：就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。工作原理：应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随即的信号检测进行定性与定量分析。具体操作:①将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；②样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；③然后按碱基配对原理将两者进行杂交;④再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。2、Taqman技术：在反映体系中加入2种不同荧光标记的探针，这两个探针分别与两个等位基因完全配对。原理：1、探针设计运用了荧光共振能量转移。2、Taq酶5'→3'外切酶的活性。3、通过不同荧光值的变化，对基因型进行分型。3、分子信标：是一种呈环状构造的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5~8个碱基对构成，5'端带有荧光发生基团，3'端带有荧光猝灭基团。4、焦磷酸测序法：是一种短片段焦磷酸测序技术，在测序引物的引导下，完毕短片段（含SNP）的测序，从而实现基因分型。缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有方法。原理：加入1分子dNTP生产1分子PPi，PPi在ATP硫酸化酶的作用下与APS反映，生产ATP，是荧光素生产氧化荧光素。SNP的应用：1、人类基因单倍型图的绘制；2、SNP与人类疾病易感基因的有关性分析；3、指导用药与药品设计。第五节基因克隆技术RACE技术（单边PCR或者锚定PCR）：是一项在已知cDNA序列的基础上克隆5′端或3′端缺失序列的技术，在很大程序上依赖于RNA连接酶连接的寡聚帽子的快速扩增。重要环节：1、获得高质量RNA；2、去磷酸化作用；（带帽子构造的mRNA不受影响）；3、去掉mRNA的帽子构造，加特异性RNA接头并用RNA连接酶连接；4、以特异性寡聚dT为引物，在反转录酶的作用下合成第一条cDNA链，其涉及寡聚接头的互补序列；5、分别以第一条cDNA链为模板进行RACE反映；6、纯化后的PCR产物克隆到载体进行序列分析。第六节蛋白质组与蛋白质组学技术双向电泳技术：是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。能将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析。蛋白质免疫印迹实验原理：1、确保蛋白质解离为单个多肽亚基能与SDS结合；2、通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离；3、将蛋白质固定于膜上；4、以抗体识别待检蛋白（抗原）。典型的印迹实验涉及五个环节：①蛋白样品的制备；②通过SDS分离样品；③将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反映活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；④用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与固定的非标记抗体结合；⑤洗去未结合的一抗，加入标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白质成分。MALDI-TOF（基质辅助的激光解析电离-飞行时间质谱）工作原理：1、将蛋白酶解；2、小肽段与基质混合；3、将样品点到金属靶表面并使之干燥结晶；4、用激光轰击，将呈离子化气体态的待分析物质从靶表面喷射出去；5、这些气体达成检测器的时间由肽段的质量和其所带的电荷数的比值（m/z)决定。第六章分子生物学研究办法(下)——基因功效研究技术原位杂交：是用标记的DNA或RNA为探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。普通可分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。酵母单杂交法原理酵母双杂交系统的原理RNA干扰技术的原理：RNA干扰技术运用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因体现，使细胞出现靶基因缺失的表型。基因芯片技术的原理：DNA芯片(DNAchip)，又称DNA微列阵(DNAmicroarray)，是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固体介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质和其它生物成分的快速、高效、敏感的解决与分析。凝胶滞缓实验：电泳迁移率变动实验又叫凝胶阻滞实验，是在80年代早期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质互相作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它含有简朴、快捷等优点，也是现在被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验办法。原理：DNA与蛋白的结合造成了电泳时迁移率的减少。噬菌体展示技术的原理：将编码“诱饵”的DNA片段插入到噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因融合。该重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接捕获靶蛋白库中与“诱饵”互相作用的蛋白质。★★★第七章基因的体现与调控（上）——原核基因体现调控模式蛋白质合成的类型：1、永久型：是指蛋白质的合成不受环境变化或代谢状态的影响，始终维持在恒定水平。2、适应型或调节型：是指蛋白质的合成速度明显地受环境的影响。第一节原核基因体现调控总论基因体现：是指DNA分子所承载的遗传信息，通过密码子—反密码子系统，转变成蛋白质或功效RNA分子的过程，称为基因体现。基因体现调控:是指对基因体现过程的调节。基因体现调控重要体现在下列几个方面：1、转录水平上的调控；2、mRNA加工成熟水平上的调控；3、翻译水平上的调控。原核基因调控机制的类型：正转录调控：调节基因的产物是激活蛋白，起着提高构造基因转录水平的作用。负转录调控：调节基因的产物是阻遏蛋白，起着制止构造基因转录的作用。原核基因调控机制的特性：诱导：调节因子与效应物结合后，启动基因的转录活性称为诱导。阻遏：调节因子与效应物结合后，关闭基因的转录活性称为阻遏。原核基因调节的重要特点：1、特殊代谢物对基因活性的调节。2、弱化子对基因活性的调节。3、降解物对基因活性的调节。4、细菌的应急反映（是指细菌在供应物全方面匮乏的状况下，难以找到代用物，所作出的一种反映，协助细菌渡过难关）。可诱导调节：是指某些基因在某些代谢物的诱导下使其活化，由原来的关闭状态转变为开放状态。如：大肠杆菌的乳糖操纵子。可诱导的操纵子：是某些编码糖和氨基酸分解代谢蛋白的基因。阻遏调节：是指某些基因由于某些代谢物的积累，而使其由原来的开放状态转变为关闭状态。如：色氨酸操纵子。可阻遏的操纵子：是某些合成多个细胞代谢过程中所必须的小分子物质。色氨酸含量和核糖体位置对弱化子构造的影响：①、当色氨酸充足时，前导序列的合成正常进行，核糖体占据1区和部分2区，2、3不能有效配对；3、4配对形成终止子的发卡构造，转录终止。②、当缺少色氨酸时，翻译在双色氨酸密码子处中断；核糖体仅占据1区，2、3区配对；3、4区不能形成发卡构造，转录继续。弱化子：是指起转录终止信号的一段核苷酸序列。弱化调节的机理：细胞中某一氨基酸或嘧啶的浓度发生变化，造成氨酰–tRNA的浓度变化，核糖体在转录产物RNA上的结合位置不同，使得RNA形成特定的二级构造，最后由RNA的二级构造判断基因能否继续转录葡萄糖效应或降解物克制作用：细菌培养基中在葡萄糖存在的状况下，即使加入乳糖、半乳糖等诱导物，与其对应的操纵子也不会启动，这种现象称为葡萄糖效应或降解物克制作用。葡萄糖效应作用机理：葡萄糖克制腺苷酸环化酶活性，造成环腺苷酸的合成减少，与其相结合的蛋白质（环腺苷酸受体蛋白CRP）因找不到受体而不能形成复合物。复合物结合在启动子区域是乳糖等糖类mRNA转录所必需的。应急反映：是指细菌在供应物全方面匮乏的状况下，难以找到代用物，所作出的一种反映，协助细菌渡过难关。★第二节乳糖操纵子与负控诱导系统诱导物：如果某物质能促使细胞产生一特定的酶，该物质就叫做诱导物。辅阻遏物：如果某物质能制止细胞产生一特定的酶，该物质就叫做辅阻遏物。安慰诱导物：可诱导酶的合成，但不被所诱导的酶降解的物质称为安慰诱导物。IPTG（异丙基巯基半乳糖苷）和巯甲基半乳糖苷（TMG）两个含硫的乳糖类似物是lac基因的安慰诱导物。操纵子：一种或几个构造基因与一种调节基因、一种操纵区构成一种操纵单元。乳糖操纵子控制模型的重要内容：①一条多顺反子mRNA编码Z、Y、A基因；②操纵区位于启动子与构造基因之间，不能单独起始构造基因的体现；③操纵区是一小段DNA序列，是阻遏物结合位点；④操纵与启动子部分重叠，当阻遏物与操纵区结合时，即制止RNA聚合酶起始转录；⑤诱导物通过与阻遏物结合，变化其三维构象，使之不能与操纵区结合，从而激发mRNA的合成。乳糖操纵子中调节基因的作用过程：lacI产生阻遏蛋白结合在lacO上，阻遏蛋白与lacO的结合会制止RNA聚合酶与启动子区的正常结合，从而造成转录无法正常进行，构造基因不能产生相对应的RNA，进而不能产生lac分解蛋白。诱导物作用的对象是阻遏蛋白。在添加lac后，lac被异构成为葡萄糖-1,6-半乳糖，进而与阻遏蛋白结合，造成阻遏蛋白失活，从lacO上分离脱落，RNA聚合酶得以正常和启动子区结合从而转录得到含有构造基因的mRNA，成果基因得以体现产生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷透过酶和β-半乳糖苷乙酰基转移酶三种酶，细胞吸取大量乳糖从而培养集中的乳糖被降解。本底水平的构成合成型：在非诱导的状态下仍有少量的lacmRNA合成，这种合成被称为本底水平的构成型合成。由于阻遏蛋白过多，与其结合的异构乳糖减少，使其恢复活性，又重新结合到操作区，使lacmRNA合成被克制。葡萄糖对lac操纵子的影响：在葡萄糖存在时，E.coli优先运用葡萄糖；此时即使培养基中含有乳糖，乳糖操纵子蛋白仍然含量很低。这是通过制止乳糖操纵子体现来完毕的，这种效应称为降解物克制（cataboliterepression）。另外葡萄糖对乳糖操纵子的另一种作用方面体现在他对cAMP的克制作用，其重要克制腺苷酸环化酶的活性，使得ATP无法通过环化作用形成cAMP造成cAMP的含量减少，从而影响cAMP-CAP的含量，而cAMP-CAP与特定的区域结合后lacoperon才干过转录形成mRNA，进而体现构造基因。lac基因产物数量，1：0.5：0.2不同酶的数量差别，是由于在翻译水平上的调节。方式有二:核糖体脱离：多顺反子的差别性翻译；内切酶作用（在lacmRNA分子内部，a基因比z基因更易受内切酶作用）.★第三节色氨酸操纵子与负控阻遏系统色氨酸操纵子:由与色氨酸合成有关的基因及其调控序列构成。当缺少色氨酸时，trp操纵子基因体现；当外源色氨酸含量较高时，操纵子中的基因受到阻遏。弱化作用：是指控制某些细菌操纵子转录终止的调节。弱化子：是指弱化所发生的终止子序列，并且这种终止是被调节的，这段序列就称为弱化子。前导区：在trpmRNA5‘端trpE基因的起始密码子前有一种长162bp的mRNA片段，被称为前导区。前导肽：由前导序列指导合成的含有14个氨基酸残基的肽称为前导肽。前导序列构造特点：第10和11位两个密码子为色氨酸密码子。转录的弱化作用：trp的缺少会造成细胞中的氨酰tRNAtrp的含量减少，从而造成核糖体通过两个trp密码子的速度慢，占据前导序列的trp1区，2区与3区配对，不能形成终止子构造，构造基因转录。而当trp浓度高时，前导肽中trp合成速度快，前导肽始终合成至其末端，核糖体占据1区和2区，3区与4区配对，形成终止子构造，使转录终止（详见课本P251）为什么需要阻遏体系？当大量Trp存在时，阻遏系统起作用。阻遏物与之结合，制止先导mRNA合成。为什么需要弱化系统？当trp浓度低时，阻遏物从有活性变为无活性，速度极慢，不能很快引发trp合成。因此需要一种能快速作出反映的系统，以保持培养基中适宜的Trp水平。Trp操纵子的其它调节机制：1、大肠肝菌中共有5个基因参加色氨酸生物合成，构成色氨酸操纵子。其中trpG-D，trpC-F为融合基因，翻译出的多肽含有双重功效。2、有两个启动子，一种位于操纵子5‘，一种位于trpG-D编码区。3、大肠肝菌色氨酸操纵子受到由色氨酸激活的负阻遏蛋白的调节作用。一旦转录越过前导区，开始构造基因的转录，又会受弱化子的调控，感受无负载的tRNATrp的变化。使转录机器在前导区附近停止或继续构造基因的转录。第四节其它操纵子半乳糖操纵子的调控与乳糖操纵子基本相似，但稍有差别：1、双启动子;2、双操纵区,一种在P区上游–67～–73，另一种在构造基因galE内部3、调节基因距离构造基因很远；4、在有外源葡萄糖时，仍然能够被低水平诱导。阿拉伯糖操纵子：（1）当葡萄糖水平较高、阿拉伯糖水平较低时，C蛋白与操纵区O2及araI诱导因子结合区上半区结合，形成DNA回转构造，araBAD基因不体现。（2）当体系中有阿拉伯糖、无葡萄糖时，AraC与阿拉伯糖相结合，变化构象成为激活蛋白，AraC同源体分别与araO1和araI区结合。RNA聚合酶在AraC蛋白和CRP-cAMP的作用下，起始BAD基因体现。第五节转录水平上的其它调控方式第一、σ因子的调节作用：不同σ因子会选择不同的起始点作为转录远点进行转录；σ因子本身活性的调节；第二、组蛋白类似蛋白的调节作用：在细菌细胞中存在的用来维持DNA高级构造的非特异性DNA结合蛋白，称为组蛋白类似蛋白。第三、转录调控因子的作用：转录调控因子：指与基因的启动子区结合，对基因的转录起激活或克制作用的DNA结合蛋白称为转录调控因子。第四、抗终止因子的调节作用：抗终止因子是能够在特定位点制止转录终止的一类蛋白质。这种调节作用重要见于噬菌体和少数细菌中。参加大肠肝菌抗终止作用的蛋白是Nus蛋白。第七节转录后调控一、mRNA本身构造元件对翻译起始的调节：AUG的识别、SD序列和mRNA的二级构造。二、mRNA稳定性对转录水平的影响：一系列核酸酶用来去除无用的mRNA。三、调节蛋白的调控作用：调节蛋白的体现本身也受到调控。四、反义RNA的调节作用：细菌细胞中某些非编码的小RNA，与mRNA中特定序列配对，变化所配对mRNA分子的构象，造成翻译过程的启动或关闭。五、稀有密码子对翻译的影响：使用稀有密码子频率较高的蛋白质，其体现率较低，多为调控蛋白。六、重叠基因对翻译的影响：细菌中重叠基因的存在，确保了同一核糖体对两个持续基因进行翻译的畅通及数量上的一致。七、翻译的阻遏：在Qβ噬菌体中，纯化的复制酶可与外壳蛋白的翻译起始区结合，克制蛋白质的合成。八、魔斑核苷酸水平对翻译的影响：细菌细胞生长过程中既要合成蛋白质，又要合成rRNA。严紧控制型（基因型rel+)：在缺少任何一种氨基酸的培养基上生长时，不仅蛋白质的合成速度下降，RNA合成速度也下降。松散控制型（基因型rel-)：当氨基酸供应局限性时，蛋白质合成即使停止了，但RNA的合成速度却没有下降。★★★第八章基因的体现与调控（下）——真核基因体现调控普通规律原核生物基因体现调控的特点：原核生物是单细胞生物，环境因子往往是调控的诱导物，每个细胞对环境变化的反映都是直接和一致的。真核生物基因体现调控的特点：能在特定的时间，特定的细胞中激活特定的基因，从而实现“预定”的、有序的、不可逆转的分化过程，并使生物的组织和器官保持正常的功效。真核基因体现调控根据性质分为两种类型：1、瞬时调控或称可逆性调控：相称于原核细胞对环境变化所做出的反映。2、发育调控或称不可逆调控：是真核基因调控的精髓部分，决定了真核细胞生长、分化、发育的全部进程。第一节真核生物的基因构造与转录活性基因家族：真核细胞中，许多功效有关的基因成套组合，称为基因家族。基因簇：同一基因家族中的组员紧密排列在一起，称为一种基因簇。单顺反子：只编码一种蛋白质的mRNA称为单顺反子mRNA。多顺反子：编码多个蛋白质的mRNA称为多顺反子mRNA。基因家族分类：1、简朴多基因家族：家族中的组员普通以串联方式前后连接形成的多基因家族，称为简朴多基因。2、复杂多基因家族：由几个有关的多基因构成，基因家族间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。3、发育调控的复杂多基因家族：血红蛋白是全部动物体内输送分子氧的重要载体，由两条a链和两条b链构成的四聚体加上一种血红素辅基（结合铁原子）后形成功效性血红蛋白。断裂基因：真核生物基因除了与mRNA相对应的编码序列外，还含有某些不编码的序列插在编码序列之间，这些非编码序列在加工为成熟的mRNA时被去除。这样的构造基因称为断裂基因。外显子与内含子的连接区特点：（1）内含子两端序列不能互补；（2）连接区序列高度保守（GT-AG法则）；构成性剪接：在高等真核生物中，内含子普通是有序或构成性地从mRNA前体中被剪接，这种剪接方式称为构成性剪接。选择性剪接：又叫变位剪接，指在剪接过程中能够有选择性地越过某些外显子或某个剪接位点进行变位剪接，产生出不同mRNA的过程，这种剪接方式称为变位剪接。真核生物转录的特点：（1）相似密码子、不同起始位点产生长度不同的蛋白质。（2）不同起始位点、不同读码次序产生不同蛋白质。（3）不同外显子的使用产生不同蛋白质。真核生物DNA水平上的基因体现调控：在个体发育过程中，用来合成RNA的DNA模板也会发生规律性变化，从而控制基因体现和生物的发育。它涉及了基因丢失、扩增、重排和移位等方式，能够消除或变换某些基因并变化他们的活性。调控方式与转录及翻译水平的调控是不同的，由于它使基因组发生了变化。涉及：1、★“开放型”活性染色质构造对转录的影响：转录之前，染色体解旋或松弛，使自由DNA暴露，造成构造基因暴露；此时HMG蛋白结合启动子，造成单链区形成，启动子暴露，产生DNaseI超敏感位点，此时DNA与RNA聚合酶和其它转录调控因子结合。2、基因扩增。3、基因重排与变换。HMG蛋白：高速泳动族蛋白，是染色体上一类低分子量非组蛋白。染色质转录的动力学模型：蛋白因子能够运用ATP水解所提供的能量，将核心组蛋白八聚体从DNA链中置换。基因扩增：是指基因的拷贝数专一性大量增加，使细胞在短时间内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要。基因重排：将一种基因从远离启动子的地方移到距离很近的位点从而启动转录，这种方式称为基因重排。DNA甲基化的重要形式：5-甲基胞嘧啶(5-mC)，7-甲基鸟嘌呤(7-mG)，N6-甲基腺嘌呤(N6-mG)。（DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化与体现。）CpG岛：CpG普通成串出现在DNA上，这段序列往往被称为CpG岛。甲基化酶：日常型甲基化酶：在甲基化母链指导下使处在半甲基化的DNA双链分子上与甲基胞嘧啶相对应的胞嘧啶甲基化。从头合成型甲基转移酶：催化未甲基化的CpG成为mCpG,它不需要母链指导，但速度很慢。DNA甲基化克制基因转录的机理：DNA甲基化造成某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的互相作用，克制了转录因子与启动区DNA的结合效率。X染色体失活中心：在失活的片段上可能存在着一种失活中心，另一片段很可能由于缺少该核心区域而保持活性，人们将该核心区域命名为X染色体失活中心。X染色体失活的机理：（X染色体上有一种失活