国家级省级长春中医药大学大学生创新创业训练计划项目申请书

级别□国家级口省级编号长春中医药大学大学生创新创业训练计划项目申请书推荐部门 吉林省人参科学研究院项目名称清腑润肠汤改善肠道上皮细胞屏障损伤的作用机制研究项目类型■创新训练项目口创业训练项目口创业实践项目所属一级学科名称 药学 所属二级学科名称 药物分析项目负责人 张若妍申报日期 2023.05二O二三年五月五、导师推荐意见该实验选题新颖，方案设计合理，可操作性强，具有一定应用价值。申报对象符合要求，同意推荐。签名:2023年5月9日六、院系推荐意见院系负责人签名:学院盖章院系负责人签名:学院盖章年月日七、学校意见:盖章年月日注：表格栏高不够可增加。填表说明一、本表请使用计算机如实准确填写各项内容。二、《申请书》一式2份，填完后，请用计算机填写，用A4纸双面打印，左侧装订。三、请准确、清晰地填写数据表各栏内容。项目类型请选择相应条目：创新训练项目、创业训练项目、创业实践项目。（1） 1.创新训练项目：本科生个人或团队在导师指导下，自主完成创新性研究项目设结合清腑润肠汤关键化合物含量与炎症因子表达水平、细胞膜通透性相关指标等统计学处理结果进行关联性分析，阐明清腑润肠汤对肠道屏障损伤修复的作用机制。.创业训练项目：本科生团队在导师指导下，完成商业计划书编制、可行性研究、企业模拟运行、创业报告撰写等工作。.创业实践项目：学生团队在学校导师和企业导师共同指导下，基于前期创新创业训练项目的成果，开发具有市场前景的创新性产品或者服务，开展创业实践活动。四、本表须经项目负责人所在学院领导和主管部门审核，签署意见并加盖公章后上报。项目名称清腑润肠汤改善肠道上皮细胞屏障损伤的作用机制研究项目类型(J)创新训练项目()创业训练项目()创业实践项目项目名称清腑润肠汤改善肠道上皮细胞屏障损伤的作用机制研究项目实施时间起始时间：2023年5月 完成时间：2024年5月申请人或申请团队姓名年级学院所在专业班级联系电话E-mail主持人张若妍2220级药学院药学一班@.com成员张文硕222。级药学院药学一班@,com张君瑜222。级药学院药学一班@.com指导教师姓名越皓研究方向药物分析学年龄46行政职务/专业技术职务研究员主要成果曾获吉林省科技进步奖一等奖2项、三等奖1项；吉林省自然科学学术成果一等奖1项、二等奖1项；吉林省拔尖创新人才；全国高等中医药院校优秀青年。主持国家重点研发计划项目1项；吉林省科技发展计划等省级项目10余项；指导大学生创新创业训练计划项目国家级3项；发表论文120余篇，其中SCI和EI论文80余篇，获得授权专利6项；作为指导教师获得第十二届“挑战杯”中国大学生创业计划竞赛铜奖1项，2020年“挑战杯”吉林省大学生创业计划竞赛特等奖1项，第六届吉林省“互联网+”竞赛银奖2项，第七届“互联网+”大赛红旅赛道国赛银奖、第八届“互联网+”大赛主赛道国赛铜奖，“吉林北药杯”二届全国中医药高等院校大学生创新创业大赛铜奖1项。一、项目实施的目的、意义便秘是一种发病率较高、覆盖人群较广的胃肠道功能紊乱性疾病，它发病常呈慢性、进展性，病程较长者可诱发加重肛裂、痔疮、结肠憩室、泻剂结肠、肛周疾病及结肠黑变病等疾病，增加结直肠肿瘤发生，诱发心血管病、脑血管意外等。我国大约有五千万的成年人存在便秘的困扰，并且便秘的患病率也随着年龄的增长逐年呈现上升的趋势。便秘不仅显著影响患者的生活质量，同时也加重了社会医疗负担。目前，药物依旧是治疗便秘的主要途径，但存在毒副作用大、药物依赖性强和新型药物价格昂贵等弊端，因此寻求一种药物替代品迫在眉睫，深入探索便秘发病机制、寻找其治疗新靶点仍是目前的研究热点。肠道屏障是由机械屏障、化学屏障、生物屏障、免疫屏障等所构成的具有维持肠内环境稳定功能，阻隔外源性有害物质进入血液循环系统的生物结构。近年研究发现，慢性便秘患者存在肠黏膜屏障结构和功能改变，故其在便秘发病中的作用受到广泛关注。大承气汤，主治阳明腑实证、热结旁流和里热实证等，现代研究证明，大承气汤可改善肠道的黏膜屏障、增强胃肠动力、抑制胃肠道炎症反应，对改善胃肠功能障碍各种临床症状有很好的疗效。但作用峻猛，不适用于气虚阴亏，燥结不甚者，以及年老、体弱、孕妇等使用，《本草纲目》云“莱瓶子之功，长于利气。生能升，熟能降。”并2020年版《中国药典》记载生地黄具有清热凉血、滋阴补肾、益精填髓的功效。故加入莱瓶子，地黄等药材制成清腑润肠汤。中药复方药效物质基础一直是中药现代化研究的热点和难点，而中药复方化学成分是重要前提，UPLC-Q-Orb-itrap-HRMS法已成为分析表征中药成分的重要技术，而来源于人体结肠癌细胞株的Caco-2细胞，与正常的人体肠上皮细胞相类似，并且可以分泌与人体相同的转化因子、酶类等，是目前很好的体外肠上皮细胞模型。基于以上研究背景，本项目基于现代制备分析技术，通过UPLC-Q-Orbitrap-HRMS对清腑润肠汤的成分进行分析，并在Caco-2细胞单层细胞模型基础上，应用酶联免疫反应（ELISA）与蛋白质印迹法（WB）技术检测紧密连接蛋白（TJP）与炎症相关细胞因子表达水平，探讨清腑润肠汤干预下对LPS诱导的Caco-2细胞炎症模型肠道屏障损伤修复机制，同时为中药复方的临床应用及质量控制提供参考。二、项目研究内容和拟解决的关键问题（一）项目研究内容：制备清腑润肠汤供试品，基于数据库信息和相关文献，采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-Q-Orbitrap-HRMS）对清腑润肠汤进行成分分析。建立Caco-2肠上皮细胞单层屏障炎症性模型，考察给予清腑润肠汤干预后模型细胞电阻TEER值、荧光素钠通过率，光密度0D值、紧密连接相关蛋白表达、炎症相关细胞因子等生化指标影响，并对相关数据进行统计学处理。结合清腑润肠汤关键化合物含量与炎症因子表达水平、细胞膜通透性相关指标等统计学处理结果进行关联性分析，阐明清腑润肠汤对肠道屏障损伤修复的作用机制。（二）拟解决的关键问题：以清腑润肠汤为研究对象，通过UPLC-Q-Orbitrap-HRMS技术分析进行化学成分分析。通过建立Caco-2细胞损伤模型以及检测肠道屏障相关紧密连接蛋白表达量等，阐明清腑润肠汤对肠道屏障损伤修复的作用机制。三、项目实施方案.清腑润肠汤的化学成分分析对照品溶液配制依据《中国药典》2020年版，称取大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄酸、芥子碱硫氧酸盐、毛蕊花糖甘、厚朴酚、辛弗林标准品，精密称定(千分之一)，加甲醇制备成，溶液，即得作为混合对照品溶液；另精密称取芦荟大黄素、大黄素、芥子碱硫氨酸盐、毛蕊花糖甘、厚朴酚、辛弗林标准品适量，置于不同量瓶中，甲醇稀释至10pig/mL,作为单标对照品溶液，均用0.22pm微孔滤膜过滤，备用。供试品溶液配置称取适量厚朴、枳实、大黄、莱熊子、地黄，加入8倍量蒸储水浸泡30min,加热至沸腾状态，微沸30min后500目滤布过滤，滤液热浸lOmin,取药渣加入6倍量蒸储水煎煮20min,滤布过滤，热浸药渣lOmin,合并2次滤液，趁热冲入芒硝，搅拌溶解后冷冻干燥，制成生药量5%的清腑润肠汤浸膏粉，4℃下保存备用。精密称取1g,加适量水超声溶解，精密移取1mL置于50mL量瓶中，甲醇定容，经0.22pim微孔滤膜过滤，即得。UPLC-Q-OrbitrapHRMS分析条件色谱条件ThermoDionexUltimate3000UPLCSigmaC18色谱柱(50mmx3.0mmx2.7|im)；流动相水(含0.1%甲酸)(A)-乙晴(B),梯度洗脱(0-5min,2%-18%B；5-10min,18%-21%B；10-20min,21-27%B；20-38min,27%-34%B；38-77min,34%-50%B；77-120min,50%-80%B；120-125min,80%-2%B)；体积流量0.4mL/min；柱温30℃；进样量5叱。质谱条件ESI离子源参数：正、负离子FullMS/ddMS?扫描模式；正离子模式下，鞘气流2.5kV；负离子模式下，鞘气流速40arb,辅助气流速lOarb,辅助气温度300℃,离子传输管温度320℃,喷雾电压2.5kV；样品全扫描质谱扫描，扫描范围m/z100.0-2000.0Da,分辨率70000FWHM；碰撞能NCE为25-55eV。1.4成分鉴定采用Xcalibur4.0软件对质谱数据进行处理分析，通过CompoundDiscoverer3.0软件将目标化合物的一级、二级质谱信息与ChemSpider、mzCloud数据库、对照品、参考文献中化合物的碎片离子峰、碎片裂解规律进行比对分析，对样品中的化学成分进行鉴定。.Caco-2细胞培养取出液氮罐中的冻存细胞，迅速放入37c水浴锅中，轻轻晃动，待细胞融化后，用DMEM培养液（含10%FBS与1%青-链霉素双抗液）置于37℃、5%CO2环境下湿化培养。细胞贴壁长至80%时，胰蛋白酶-EDTA液按比例消化传代，取指数期细胞接种到transwell小室中，细胞培养3周时，获得融合的单层细胞。.清腑润肠汤对LPS诱导的Caco-2上皮细胞屏障损伤的改善机制的研究模型建立与实验分组实验分为3组，即空白对照组（control）、模型组（LPS）、供试品组（LPS+清腑润肠汤），用CCK-8法确定供试品毒性范围。根据实验要求分别在实验开始后的lh、3h、6h、12h测定TEER,6小时后测定紧密连接蛋白表达。CCK-8法测定不同浓度清腑润肠汤对细胞活力的影响取对数生长期Caco-2细胞，调整细胞浓度为1x105个/mL,于96孔细胞培养板中，为对照组（正常培养）、LPS组（2ng/mLLPS处理24h）、LPS+低剂量供试品组（lOpg/mL清腑润肠汤预处理30min,2（ig/mLLPS处理24h）和LPS+高剂量供试品组（40pig/mL清腑润肠汤预处理30min,2ng/mLLPS处理24h）。待培养完毕，更换96孔板中的培养液，向每孔加入IOrL的CCK-8溶液，再培育1-2h。用酶标仪测定450nm处的吸光度，并准确记录OD值。计算细胞活力。计算公式：细胞活力一（处理组光密度值/对照组光密度值）X100%单层肠上皮细胞跨膜电阻TEER的测定接种细胞于Transwell小室，实验前测定跨上皮细胞电阻（transepithelialele--ctriealresistance,TEER）,以验证细胞融合状态和肠上皮屏障的完整性，各组（对照组、LPS组、LPS+供试品组）处理48h,吸去Transwell内外的培养液，用HBSS液（pH7.4）冲洗细胞3次，并在37℃孵育30min,重新测量TEER值，TEER值降低不超过原测值的10%,继续进行试验。细胞单层TEER=（实测TEER-空白TEER）xTranswell有效膜面积，单位：Qcm2o荧光素钠透过性检测在Transwell顶端腔内加入含有终浓度为100|ig/ml荧光素钠的HBSS液100似,37℃孵育4h,收集腹侧腔液体，在荧光分光光度计下测定吸光度（激发波长427nm,发射波长536nm）。根据标准曲线，计算透过到基底侧荧光素钠的浓度。Westernblot检测肠上皮细胞紧密连接Occludin、claudin-1和ZO-1蛋白取各分组共培养24h蛋白，加入loadingbuffer煮沸90s使蛋白质变性，取20ul蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳，250mA恒定电场下将蛋白转至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉4c封闭过夜，加入相应的一抗室温孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次lOmin。加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育lh,TBST缓冲液洗膜3次，每次lOminoECL法显色后进行结果分析。采用ImageJ软件分析Western-blot灰度值。清腑润肠汤对Caco-2细胞因子IL-1B、TNF-a、IL-6和IL-10浓度的影响按照ELISA试剂盒操作说明，测定IL-1B、TNF-a、IL-6和IL-10细胞因子质量浓度。统计学处理数据均使用“平均值土标准差”表示，使用SPSS