生物技术制药复习题

生物技术制药复习题第一章绪论第一节生物技术的发展史1、生物技术：以生命科学为基础，运用生物体的特性和功效，设计构建含有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，运用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一种综合性技术体系。它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。基因工程是生物技术的核心。P12、蛋白质工程第二代基因工程；海洋生物技术第三代生物技术P13、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、当代（DNA重组）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1975年，Koher和Milstein建立了单克隆抗体技术1982年，第一种基因工程药品重组人胰岛素被同意上市1989年，我国第一种基因工程药品干扰素同意上市，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一种正式同意的基因治疗药品。第二节生物技术药品1、生物技术制药：生物技术制药：采用当代生物技术人为地发明某些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。P42、生物技术药品：采用DNA重组技术活其它生物技术研制的蛋白质或核酸类药品。它与天然生化药品、微生物药品、海洋药品和生物制品共同归为生物药品。3、当代生物药品分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药品；天然药品；合成与部分合成药品。4、生物药品按用途分为：治疗药品；防止药品；诊疗药品。5、生物技术药品的特性：（1）分子构造复杂；（2）含有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检查的特殊性。第三节生物技术制药1、生物技术制药的特性：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。P52、生物技术在制药中的应用有哪些？P7（1）基因工程制药：①开发基因工程药品，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗体，它能够作为导向药品的载体④基因诊疗与基因治疗⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型⑥应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药品⑦改善药品生产工艺⑧运用转基因动、植物生产蛋白质类药品。（2）细胞工程制药①单克隆抗体技术②动物细胞培养③植物细胞培养生产次级代谢产物。（3）酶工程制药：酶与细胞的固定化及酶转化制药（4）发酵工程制药：发酵工艺改善、新药研制、菌种改造。第二章基因工程制药第一节概述（略）第二节基因工程药品的生产过程P151、基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和体现的技术。2、基因工程药品制造的重要程序（过程）（重点和背面几节联系起来）（1）目的基因的克隆（分离目的基因）：通过逆转录、反转录-聚合酶链式反映、化学合成办法来制备cDNA，再通过核酸探针杂交或免疫反映来筛选目的基因（2）目的基因与载体连接构建DNA重组体：通过限制性内切酶DNA连接酶等核酸酶，把目的基因组入载体的有关克隆位点，惯用的载体有质粒载体和噬菌体载体（3）将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌：惯用的宿主菌有大肠杆菌、酵母菌等，先使宿主菌处在感受态，再通过转化、转导等方式把重组DNA导入宿主菌，以构建工程菌（4）工程菌发酵：提供适宜的培养基、反映器、控制好发酵过程中的多个参数，如温度、PH、溶氧等，并通过升温来诱导产物体现（5）目的基因体现产物的分离纯化：通过固液分离、初步纯化、高度纯化、成品加工来制备产品；若是胞内产物需要细胞破碎，若是包涵体则需要变性和复性（6）产品的检查：检测产品的质量和性能。第三节目的基因的获得1、运用基因工程生产蛋白质或多肽需要得到其基因，制备目的基因惯用的办法有哪些？P16（1）逆转录法以mRNA为模板，经逆转录的到cDNA，构建cDNA文库，从cDNA文库中筛选目的基因。由于RNA转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文库中无内含子，适于在原核系统中体现。但是，cDNA只包含蛋白质的构造基因部分，缺少有关的调控序列，因此在原核系统中体现，还需要根据体现载体的构造，配以对应的调控序列。（2）运用反转录-聚合酶链式反映制备基因（3）化学合成法：只合用于克隆小分子肽的基因2、运用逆转录法获得目的基因的基本过程P16（1）mRNA的纯化：从体现目的基因的细胞中提取总RNA，用寡聚脱氧胸苷（dT）纤维素柱从总RNA中提取纯化mRNA。（2）cDNA的合成：以mRNA为模板，运用逆转录酶合成cDNA第一链，再用DNA聚合酶合成cDNA的双链。（3）cDNA克隆：运用适宜的连接办法，将产生的双链cDNA片段插入到适宜的载体中。（4）构建cDNA文库：将cDNA与载体连接的重组体转入大肠杆菌中，产生的克隆群体为cDNA文库。（5）从cDNA文库中筛选目的基因：得到cDNA文库后，普通采用核酸探针杂交法和免疫反映鉴定法从数以万计的DNA片段中筛选出目的基因。3、载体分为：体现型载体和非体现型载体。P17第四节基因体现1、基因体现：指构造基因在生物体中的转录、翻译以及全部加工过程。P202、基因高效体现研究：指外源基因在某种细胞中的体现活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一种基因体现体系中，使其能获得原生物活性又可高产的体现产物。P203、基因体现的微生物宿主细胞分为两大类：P21第一类为原核细胞（惯用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）；⑴大肠杆菌（现在仍是基因工程研究中采用最多的原核体现体系）：体现基因产物形式多样，大肠杆菌中的体现不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力局限性，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，体现产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多出一种蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。⑵枯草芽胞杆菌：分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。⑶链霉菌：作为外源性基因体现受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、体现产物可糖基化。第二类为真核细胞（惯用的真核微生物有酵母、丝状真菌等）⑴酵母：酵母菌是研究基因体现最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖快速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功体现⑵丝状真菌：分泌能力强，能对的进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后解决工艺。4、现在使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。P225、大肠杆菌基因体现载体P23（1）pBV220系统pBV220系统国内使用最多的载体,其构成：①来源于pUC8多克隆位点；②核糖体rrnB基因终止信号；③pBR322第4225～3735位；④pUC18第2066～680位；⑤λ噬菌体cIts857克制子基因及PR启动子；⑥pRC23的PL启动子及SD序列（2）pET系统6、影响目的基因在大肠杆菌中体现的因素P22外源基因体现产量与细胞浓度和细胞体现产量呈正有关。单个细胞产量取决于：（1）外源基因的剂量：普通来说细菌内基因拷贝数增加，基因的体现产物也增加。（2）外源基因的体现效率①启动子的强弱：启动子是在转录水平上影响基因体现的因素。需要寻找强的启动子。②核糖体结合位点的有效性：大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效体现是十分重要的。③SD序列和起始密码ATG的间距：体现非融合蛋白的核心是原核SD序列和真核起始密码ATG之间的距离，距离过长过短都影响真核基因的体现。④密码子构成：应选择使用大肠杆菌偏爱的密码子。（3）体现产物的稳定性：（4）细胞的代谢负荷：必须使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效体现出外源基因产物。（5）工程菌的培养条件外源基因的高水平体现，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的互有关系，并且与其所处的环境条件息息有关，必须进行优化。7、真核基因在大肠杆菌中的体现形式P26⑴以融合蛋白的形式体现药品基因以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，体现蛋白在菌体内稳定，易实现高效体现；缺点：只能作抗原用。⑵以非融合蛋白的形式体现药品基因非融合蛋白指在大肠杆菌中体现的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。⑶分泌型体现药品基因（外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游）优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；缺点：产量不高，信号肽不被切割。8、载体有关定义载体：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。克隆载体：从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为载体，在其上插入适宜大小的外源DNA片段，将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。体现载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加体现元件(如启动子、RBS、终止子等)，是目的基因能够体现的载体。穿梭载体：指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体（例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体）。9、载体的复制系列可分四类：P27（1）Yep类（酵母附加体质粒）（2）YRp类（酵母复制型质粒）（3）YCp类（酵母着丝粒质粒）（4）YIp类（酵母整合型质粒）10、影响目的基因在酵母菌中体现的因素⑴外源基因的拷贝数⑵外源基因的体现效率：①启动子②分泌信号的效率③终止序列的影响⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影响：①菌体生长力强②菌体内源蛋白酶要较弱③菌体性能稳定④分泌能力强11、精确体现载体P28酵母载体有两类：普通体现载体和精确体现载体。精确体现载体：规定在启动子或前导肽编码序列的适宜部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在体现和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相似，既无多出的氨基酸，也无缺失的氨基酸的克隆载体。第五节基因工程菌生长代谢的特点1、碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量不不大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，造成培养基的pH值下降，从而影响菌体的生长。适宜提高pH，可减少乙酸的克制作用；P31第六节基因工程菌的不稳定性1、质粒不稳定分为那两类？P32工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和构造不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌在分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌的现象。与含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌比数率差别的大小有关质粒的构造不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的变化。基2、提高质粒稳定性的办法P33（1）选择适宜的宿主菌：遗传稳定（2）选择适宜的载体：高拷贝数；（3）选择压力：如加抗生素提高稳定性；（4）分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的体现（5）控制培养条件（6）固定化第八节重组工程菌的培养1、基因工程菌的培养方式P36（1）分批培养（2）补料分批培养：将种子接入发酵反映器中进行培养,通过一段时间后间歇或持续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的办法。（3）持续培养（4）透析培养（5）固定化培养2、基因工程菌的培养工艺P37（1）培养基的影响（2）接种量的影响（3）温度的影响（4）溶氧量的影响（5）诱导时机的影响（6）诱导体现程序的影响：普通在对数生长久或对数生长后期升温诱导体现。（7）pH的影响：生长pH在6.8～7.4左右，后期外源蛋白的体现其最佳pH为6.0～6.5。第九节高密度发酵（1）高密度发酵：一种相对概念，普通指培养基中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L。（2）影响高密度发酵的因素：培养基；溶氧浓度；pH；温度；代谢副产物（3）实现高密度发酵的办法①发酵条件的改善a.培养基的选择（普遍采用6g/L的甘油为碳源）；b.建立流加式培养的方式；c.提高供氧能力②构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌a.阻断乙酸产生的重要途径；b.对碳代谢流进行分流；c.限制进入糖酵解途径的碳代谢流；d.引入血红蛋白基因③构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌第十节基因工程药品的分离纯化1、体现的产物都是多肽或蛋白质，它的制得含有下列特点：（1）体现产物在初始料中含量较低；（2）含有大量细胞及代谢产物；（3）体现产物稳定性差，易失活变性；（4）体现产物的种类繁多、构造不一、活性各异；（5）对其质量规定纯度高、无菌、无热原。2、分离纯化的基本过程若是叙述题最佳对过程进行一定的介绍3、建立分离纯化工艺的根据（1）含目的产物的起始料的特点基因工程菌的发酵产物其上游过程的多个因素对分离、纯化工艺有影响。涉及：①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养基的来源及其质量。③生产工艺及条件。（2）物料中杂质的种类和性质。（3）目的产物特性。（4）产品质量的规定4、细胞破碎与固液分离⑴细胞收集：离心法、膜分离法。⑵细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法；物理法、化学法、生物法⑶固液分离：离心、膜过滤、双水相萃取5、细胞破碎的办法；P47（1）物理办法：匀浆法、珠磨法、超声波法（2）化学法：渗入冲击法（高渗+低渗）、增溶法（表面活性剂等）（3）生物法：酶溶法6、分离纯化惯用的色谱分离办法有那些？P50分离纯化重要依赖色谱分离办法。色谱技术是医药生物技术下游过程精制阶段的惯用手段，其优点是该法含有多个多样的分离机制、设备简朴、便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。（1）离子交换层析P51离子交换介质由三部分构成：（1）不溶性高分子聚合物—载体；（2）共价键结合于载体上活性基团或功效集团（3）与活性基团带相反电荷平衡离子或反离子（决定是阴离子交换树脂还是阳离子交换树脂）如：酸性阳离子交换树脂R-SO3H蛋白质的等电点和表面电荷的分布重要影响离子交换的性能。它由平衡、上样、洗脱（分为梯度洗脱和阶段洗脱2种）、再生4个重要环节构成。（2）疏水层析P54运用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的互相作用，无机盐的存在能使互相作用力增强。流动相为pH6～8盐水溶液。惯用的介质是多聚糖（如琼脂糖）和硅胶。（3）亲和层析P4756亲和层析是运用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用。洗脱时分为特异性洗脱和非特异性洗脱。（4）凝胶过滤层析P59凝胶过滤是以含有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，大分子量物质先流出，小分子物质后流出。运用这种移动差别可使大分子与小分子分开。7、用于分离纯化的技术应满足那些规定？P62(1)技术条件温和，能保持目的产物的生物活性。(2)选择性好，能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来，达成较高纯化倍数。(3)收率要高。(4)两个技术之间不需要对物料加以解决或调节，这样能够减少工艺环节。(5)整个分离纯化过程要快速，能够满足高生产率的规定。第十一节变性蛋白的复性1、外源基因在大肠杆菌中的高体现经常造成包涵体的形成P632、包涵体：指细菌体现的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。3、包涵体的分离和溶解P63（1）包涵体的分离：重组菌破碎后，离心得沉淀部分，再用低浓度变性剂（脲或盐酸胍）、去垢剂（TritonX-100）、脱氧胆酸钠洗涤。（2）包涵体溶解：般用强的变性剂如脲（6-8M）、盐酸胍（6M），或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等，溶解涵体蛋白质。（3）包涵体复性：稀释复性和透析复性；含二硫键的蛋白的复性；封闭蛋白的疏水蔟增进复性；凝胶过滤层析复性；小分子添加剂增进的复性；分子伴侣或折叠酶增进的复性；人工分子伴侣的复性第十二节基因工程药品的质量控制1、由基因重组技术所获得的蛋白质药品产品进行鉴定时，常作那些项目分析？P68（1）肽图分析肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质后，对生成的肽段进行的分离分析。它是一种可检测蛋白质一级构造中细微变化的最有效办法，该技术敏捷高效的特点使其成为对基因工程药品的分子构造和遗传稳定性进行评价和验证的首选办法。（2）氨基酸成分分析在氨基酸成分分析中，普通含50个左右的氨基酸残基的蛋白质的定量分析是靠近理论值的，即与序列分析成果一致。（3）部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析（N端15个氨基酸）可作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定指标。（4）重组蛋白质的浓度测定和分子量测定蛋白质浓度测定办法重要有凯氏定氮法、双缩脲法、染料结合比色法、福林-酚法和紫外法等。蛋白质分子量测定最惯用的办法有凝胶过滤法和SDS法，凝胶过滤法是测定完整的蛋白质分子量，而SDS法测定的是蛋白质亚基的分子量。（5）蛋白质二硫键分析二硫键和巯基与蛋白质的生物活性亲密有关，基因工程药品产品的硫-硫键与否对的配对是一种重要问题。第三章动物细胞制药第一节概述细胞工程：是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地运用第二节动物细胞的形态和生理特点（重点）1、离体培养的动物细胞分为那些类型？P81动物细胞适应功效,形态各异。离体培养细胞分两类：贴壁细胞；悬浮细胞（1）贴壁细胞生长须有贴附的支持物表面，本身分泌或培养基中提供的贴附因子才干在该表面上生长。两种形态：成纤维细胞型和上皮细胞型（2）悬浮细胞：生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。（3）兼性贴壁细胞：生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。2、什么是接触克制现象？P84当细胞在基质上分裂增殖，逐步汇合成片时，即每个细胞与其周边的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍可存活相称一段时间，但细胞密度不再增加，因此该现象又称之谓接触克制或密度依赖克制现象。一旦细胞转化为异倍体后，该现象随之消失，细胞可多层生长。细胞密度也就可大大增加。3、动物细胞的生理特点P83（1）细胞的分裂周期长动物细胞分裂所需的时间普通为12～48h，它不仅随细胞种属的不同而不同，就是同一种属的，不同部位的细胞其所需的时间也不同。周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M）（2）细胞生长需贴附于基质，并有接触克制现象(3)正常二倍体细胞的生长寿命是有限的(4)动物细胞对周边环境十分敏感。动物细胞对多个物理化学因素，如渗入压，pH，离子浓度，剪切力，微量元素等的变化耐受力很弱。(5)动物细胞对培养基的规定高氨基酸、维生素，多个无机盐和微量元素，细胞生长因子、贴壁因子。(6)动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功效与细菌不同动物细胞的蛋白质合成除了在游离的核糖体上进行外，还在与糙面内质网上结合的核糖体上进行。（游离核糖体合成蛋白质用于细胞质基质内。粗面内质网的核糖体合成蛋白质是分泌的和膜中的整合蛋白多为糖蛋白。）3、动物细胞作为宿主细胞生产药品的特点；P85（1）优点：产品多分泌在胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，因此与天然产品更一致，适于临床（2）缺点：培养条件规定高，成本贵，产量低第三节生产用动物细胞的规定和获得1、生产用动物细胞的种类及其特点P86用于生产的动物细胞有三类，即原代细胞、已建立的二倍体细胞系、以及可无限期传代的转化细胞系，以及用这些细胞进行融合和重组的工程细胞。(1)原代细胞原代细胞是直接取自动物组织、器官，通过分碎，消化而获得的细胞悬液。用得最多的是鸡胚细胞，原代兔肾或鼠肾细胞，以及血液的淋巴细胞。(2)二倍体细胞系原代细胞通过传代、筛选、克隆，从而从多个细胞成分的组织中挑选，并纯化出某种含有一定特性的细胞株。该细胞株仍含有“正常”细胞的特点，普通均从动物的胚胎组织中获取。(3)转化细胞这类细胞是通过某个转化过程形成的，它经常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了“正常”细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。由于转化的细胞含有无限生命力，并且经常倍增时间较短，对培养条件和生长因子等规定较低，故更适于大规模工业化生产的需要。(4)其它：融合细胞系（物理法如高压电场和化学法如仙台病毒、聚乙二醇）和重组工程细胞系2、真核细胞基因体现载体的构建，使用的载体有两类：（1）病毒载体：牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒；（2）质粒载体：穿梭质粒载体P883、重组DNA导入动物细胞的惯用办法：融正当、化学法、物理法、病毒法，最惯用磷酸钙沉淀法、电穿孔法P894、生产用的工程细胞必须建立两个细胞库：原始细胞库（MCB）、生产用细胞库（MWCB）或工作细胞库（WCB）P91第四节动物细胞的培养条件和培养基1、动物细胞的培养条件P92(1)器材的清洗和消毒①器材的清洗:浸泡、刷洗、泡酸、冲洗②器材的消毒灭菌:物理消毒/化学消毒(2)水质:电阻值不不大于18MΩ,去热原。(3)pH:7.2～7.4(4)渗入压:290～300mOsm/kg(5)温度:哺乳动物37±0.5C；(6)空气:氧的饱和质60%,氧分压4～0.7kPa2、培养动物细胞的培养基的种类和构成P95动物细胞培养基大致能够分成三类：天然培养基，合成培养基和无血清培养基。（1）天然培养基：血清、羊水、腹水等,成分复杂、成分不稳定（2）合成培养基：成分明确、大量供应，DME、MEM、DMEM等（第一种合成培养基是199培养基；①氨基酸：12种必需氨基酸+谷氨酰胺②维生素：形成辅基和辅酶③糖类：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺④无机盐：维持渗入压⑤其它成分：核酸前体和氧化还原剂如谷胱甘肽⑥添加5%～10%小牛血清：作用是提供生长因子和激素；提供贴附因子和伸展因子；提供结合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素（3）无血清培养基：无血清培基的优点以下：①提高了细胞培养的可重复性，避免了由于血清批间差别的影响。②减少了由血清带来病毒、霉菌和支原体等微生物污染的危险。③供应充足，稳定。④细胞产品易于纯化。⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性。⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于对实验成果的分析。（简答题时候能够不写优点）无血清培养基加入添加剂：生长因子和激素（胰岛素）；结合蛋白（鉄传递蛋白和白蛋白）；贴附因子和伸展因子（胶原等）；有利细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽）动物细胞培养的基本办法1、细胞传代；P101原代培养形成的单层细胞汇合后来，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间局限性或由于细胞密度过大引发营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。传代办法：（1）悬浮细胞：加生长液，然后分种（2）贴壁生长细胞传代：采用酶消化法传代。惯用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第六节动物细胞大量培养办法和操作方式1、动物细胞大规模培养的办法P103（1）悬浮培养悬浮培养即让细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖。优点是操作简便，培养条件比较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，不仅细胞体积较小，较难采用灌流培养，因此细胞密度普通较低。（现在在生产中用于悬浮培养的设备重要是通气搅拌罐式生物反映器和气升式生物反映器。）2．贴壁培养贴壁培养是必须让细胞贴附在某种基质上，细胞才干生长繁殖的培养办法。较容易采用灌流培养的方式使细胞达成高密度。但操作比较麻烦，需要适宜的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。3．贴壁—悬浮培养①微载体培养：可发明相称大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，载体的体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内。②包埋和微囊培养：包埋和微囊培养培养细胞不是贴附在载体表面，而是被包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；能够获得较高的细胞密度；可采用多个生物反映器进行大规模培养。（现在最普遍的是琼脂糖和海藻酸钙凝胶）③结团培养：结团培养的实质是用细胞本身作为基质，互相贴附后，再用悬浮的办法进行培养，因此它也是一种贴附—悬浮培养。该培养办法操作简便，节省了微载体的成本。2、动物细胞培养的操作方式；P106动物细胞培养的操作方式普通可分为分批式、加料—分批或流加式、半持续式、持续式和灌流式。（1）分批式操作（一种是将细胞和培养基一次性加入反映器内进行培养，此后细胞不停增加，产物不停形成和积累。最后将条件培养基，即经培养已含有细胞产物的培养基，或连同细胞一并取出，培养结束。另一种是先将细胞和培养基加入反映器，待细胞生长至一定密度后，往反映器内加入诱导剂或病毒等，经一段时间作用后，将反映物取出。）（2）半持续式操作（该方式是当细胞和培养基一起加入反映器后，在细胞增加和产物形成过程中，每间隔一段时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续培养。该操作方式在动物细胞培养和药品生产中被广泛采用。）（3）灌流式操作（该方式是当细胞和培养基一起加入反映器后，在细胞增加和产物形成过程中，不停地将部分条件培养基取出，同时不停地补充新鲜培养基。它与持续式操作不同处，在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞仍保存在反映器内，而持续式培养则同时也取出部分细胞。）括号部分的内容重在理解第七节动物细胞生物反映器1、动物细胞生物反映器必需含有的基本规定；P107（1）一切材料，对细胞必须无毒性。（2）含有良好的传质、传热和混合的性能。（3）密封性能良好（4）对多个物理化学参数能自动检测、调节和高精度控制（5）可长久持续运转（6）容器内面光滑，无死角（7）拆装、连接和清洁方便，能耐高压蒸汽消毒，便于操作维修。设备成本尽量低。2、动物细胞生物反映器的类型及特点；P108（1）搅拌罐式生物反映器（现在最广泛应用的动物细胞反映器）：靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范畴、良好的混合性和浓度均匀性（2）气升式生物反映器：其特点是构造简朴，操作方便。（3）固定床式生物反映器：构造简朴、装填材料无毒且利于细胞贴壁，剪切力小的特点（4）流化床式生物反映器：可持续操作（5）袋式或膜式生物反映器：可取出某些有害代谢物（6）中空纤维生物反映器：用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度高，如果控制系统不受污染，能长久运转。3、反映器及检测；P114（1）温度检测元件：电阻温度计；（2）PH：复合式参比电极（3）溶氧：极普电极或电流式覆膜电极第十节动物细胞制药的前景与展望1、动物细胞制药有哪些新进展？P135（1）改善体现载体，提高体现水平和产量：①采用更强的启动子和增强子②更加好的运用扩增系统或寻找高体现位点③采用和改造更加好的宿主细胞（2）运用代谢工程，改善培养工艺，减少生产成本：①采用代谢工程改造工程细胞②改善培养工艺，减少生产成本（3）克制细胞凋亡，延长培养周期（4）采用糖基化工程，提高产品质量（5）转基因动物的研究（6）组织工程的研究2、代谢工程：采用基因工程的手段，使工程细胞增加或减少某种酶，改造它的代谢能力和途径，使其减少对某些营养物质的需求，减少某些代谢产物的产生和无害，以及控制工程细胞的增殖速度和制造产品的能力。P137第四章抗体制药第一节概述P1431、抗体：即Ig，指能与对应抗原特异性结合含有免疫功效的球蛋白。2、1975年Kohler和Milstein首先运用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体（McAb）。3、单克隆抗体：将抗体产生细胞与含有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的特异性完全相似的高纯度抗体。单克隆抗体有缺点：分子量过大；鼠源性抗体；因此要改造：减少单克隆抗体的免疫源性和减少其相对分子量。P144第二节单克隆抗体及其制备（重点）1、克隆化：指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程。P1482、什么是单克隆抗体？它是如何制备的？P144（1）抗原与动物免疫①制备高纯度抗原：抗原能够用化学合成，如精制地高辛。多数抗原物为混合物须经免疫、筛选、克隆化。②用抗原免疫脾细胞的制备：有体内免疫法和体外免疫法。体内免疫就是将抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠产生免疫反映，B细胞快速增殖；体外免疫小鼠脾细胞的悬浮液与抗原一起培养后，再分离脾细胞。（2）细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养①骨髓瘤细胞：和免疫动物同源，现在惯用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠（最惯用）和LOU大鼠。②脾细胞和骨髓瘤细胞融合：脾细胞（1×108）和骨髓瘤细胞（2×107）混合，在聚乙二醇诱导下融合2分钟，然后用培养液将融合液缓慢稀释。（惯用PEG相对分子量4000，浓度为40-50%，二甲基亚砜增加融合率）③选择性培养:选择培养基为HAT培养液。次黄嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。其上脾—瘤融合细胞能够生长，脾—脾、、瘤—瘤融合细胞死亡。（培养基中需要加入喂养细胞才干繁殖，惯用喂养细胞是小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞等）（3）筛选阳性克隆与克隆化①筛选阳性克隆惯用检测办法：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术等。②克隆化：有限稀释法（将对数生长久的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。）和软琼脂法（将杂交瘤细胞稀释到一定密度，然后与琼脂混悬。在琼脂中的细胞不能自由移动，彼此互不相混，从而达成单细胞培养的目的）（4）杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定杂交瘤细胞鉴定：染色体分析。另外还检测抗体特异性、纯度、分子量等。（5）单克隆抗体的大量制备①体外培养法和体内诱生法，多采用后者②体内诱生法：降脂烷注射小鼠腹腔后再接种杂交瘤细胞，取腹水，离心，取上清。（6）单克隆抗体的纯化依单抗IgG类和亚类不同，选多个不同的纯化办法。体内诱生法单克隆抗体的纯化办法：①离心取上清，超滤，盐析。②分离：凝胶过滤用于IgGIgM单抗纯化；阴离子交换层析IgG单抗纯化；亲和层析IgG单抗纯化。3、ELISA法：酶联免疫吸附实验，基本办法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反映板)表面，使酶标记的抗原抗体反映在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。原理：酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会变化抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反映。因此，可通过底物的颜色反映来鉴定有无对应的免疫反映，颜色反映的深浅与标本中对应抗体或抗原的量呈正比。P147第三节基因工程抗体及其制备（即鼠源性单克隆抗体的改造）1、基因工程抗体：过

PCR

技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适宜载体重组后引入不同体现系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床临床诊疗、防止、治疗及基础理论研究等领域。

P1502、Ig分子构造P150（1）由2条重链(简称H链)和2条轻链（简称L链）构成"Y"字型构造分子，链与链之间由一对或一对以上的二硫键互相连接（2）Ig分子氨基酸端L链的1/2与H链的1/4的氨基酸构成及次序多变，构成可变区(简称V区)，V区中某些特定位置构建抗体和抗原特异结合的核心部位，称为互补决定区（CDR）它赋于抗体以特异性。（3）羧基端L链的1/2与H链的134的氨基酸构成及次序较恒定，构成恒定区(简称C区)，它决定Ig分子的异种抗原性。（4）L链有VL和CL连个功效区，H链有VH、CH1、CH2、CH3四个功效区，VL和VH的CDR区共同构成一种抗原结合部位。3、基因工程抗体及其特性和制备办法（P152图4-4）（1）人鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区（V区）基因分离出来，分别与人Ig的H和L链的稳定区（C）基因连接成人-鼠嵌合抗体的H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能体现完整人-鼠嵌合抗体。人IgC-小鼠IgV（2）改形抗体（CDR移植抗体）：用鼠源单抗的CDR序列替代人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子含有鼠源单抗的抗原结合特异性。可消除免疫源性。小鼠CDR替代人CDR（3）Fab抗体：重链V区及CH1功效区与整个轻链以二硫键形式连接而成，重要发挥抗体的抗原结合功效。Fab抗体只有完整IgG的1/3。（Fd：重链V区及CH1功效区）完整L链+重链V区+CH1功效区（4）Fv抗体：由VH和VL构成的含有完整抗原结合位点的最小抗体片段；VH+VL（5）单链抗体：即scFv，由VH和VL通过连接肽（接头）重组并体现而成的一种小分子抗体，其分子量。VH-多肽-VL（6）单域抗体：只有VH或VL一种功效构造域，也能保持原单克隆抗体的特异性。其分子量仅为整个Ig分子的1/12。VH或VL（7）最小识别单位：即MRU，只含有一种CDR多肽的抗体，也为超变区多肽。第四节多功效抗体及其制备1、双功效抗体：bisFvs，即双特异性单链抗体，（天然Ig是由两个完全相似的VH和VL区域构成，该区域是特异性识别并结合抗原的核心部位）经人工设计构建的双特异性抗体由两个不同的抗原结合位点构成，可同时与两种不同的抗原决定簇结合，并可将其偶连的药品、酶或放射性核素等导向到靶部位，这种含有双价双特异性的抗体又称为双功效抗体。P1552、多功效抗体：在scFv的基础上，能够把两个或两个以上的scFv重组在一起，由此可制备成多价小分子抗体即微型抗体（简称多价微抗）。P1573、抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白含有新的特性，称之为抗体融合蛋白。P158第五节抗体工程1、抗体工程：指运用重组DNA和蛋白质工程技术，对抗体基因进行加工改造和重新装配，经转染适宜的受体细胞后，体现抗体分子，或用细胞融合、化学修饰等办法改造抗体分子的工程。P159现在普遍使用噬菌体作为抗体库技术的载体。6．噬菌体抗体库技术基本办法（过程）P159噬菌体抗体库技术：它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行体现，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。基本过程：噬菌体抗体库技术基本路线为用RT-PCR办法扩增抗体全套可变区基因（VH+VL），重组到噬菌体载体中，并通过与丝状噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，把Fab段或ScFv体现到噬菌体表面。通过“吸附－洗脱－扩增”的富集过程，从中筛选出特异性抗体的可变区基因。（右图）第六节抗体诊疗试剂一、三大类抗体诊疗药品：血清学鉴定用抗体制剂、免疫标记技术用抗体制剂、体内导向诊疗药品。P161二、抗体诊疗药品有哪些类型？P1611.血清学鉴定用的抗体类试剂（1）鉴定病原菌用的抗体试剂（2）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的反向被动血凝诊疗试剂（3）妊娠诊疗试剂（4）抗ABO血型系统血清2、免疫标记技术用的抗体类试剂P164给抗体标记放射性核素、荧光素或酶活性，能将抗原抗体反映放大，使常规不能观察的反映得以显现，可对微量抗原进行定性定量测定，敏捷度提高。结合显微镜技术，还可对抗原物质作出组织内或细胞内的定位测定。（1）荧光抗体诊疗试剂：荧光抗体是用荧光色素,如异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、藻红素（PE）等标记抗体蛋白，即成荧光抗体。用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞，荧光抗体就与抗原结合，在荧光显微镜下成为发光的可视物，从而达成诊疗和定位的目的。（2）免疫酶抗体诊疗试剂：酶标诊疗试剂a、HBsAg(乙型肝炎表面抗原)酶标诊疗试剂b、HBeAg(乙型肝炎e抗原)酶标诊疗试剂c、HAVAg(甲型肝炎病毒抗原)酶标诊疗试剂d、测定HIV（人免疫缺点病毒）抗原的酶标诊疗试剂e、AFP（甲胎蛋白）酶标诊疗试剂f、CEA（癌胚抗原）酶标诊疗试剂（3）放射免疫用抗体诊疗试剂把放射性核素分析的高敏捷性与抗原抗体反映的特异性两大特点结合起来建立的检测技术。能测出ng/ml，甚至pg/ml水平的微量抗原物质。惯用的标记抗体试剂：a、HBsAg放射性核素标记抗体诊疗试剂：125I标记，敏捷度0.1ng/mlb、HBeAg放射性核素标记抗体诊疗试剂：125I标记，敏捷度0.1ng/mlc、HAV抗原放射性核素标记抗体诊疗试剂：125I标记d、AFP放射性核素标记抗体诊疗试剂：125I标记，敏捷度1~5ng/mle、CEA放射性核素标记抗体诊疗试剂：125I标记，敏捷度1ng/ml3、导向诊疗药品由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，因此导向药品尚未爱临床广泛应用。三、CD单克隆抗体系列P169应用以单克隆抗体鉴定为主的办法，将来自不同实验室的单克隆抗体所识别的同一种白细胞分化抗原归称为CD（clusterofdifferentiation）。人CD的编号已从CD1命名至CD247，大致分为13组。第七节抗体治疗药品1、抗体治疗药品有哪些？P173以抗体为载体的导向治疗药品，还不成熟。（1）放射性核素标记的抗体治疗药品抗体作为放射性核素的导向载体，标记操作简便用量小。放射性核素标记的抗体对肿瘤细胞杀伤较大。（2）抗癌药品偶联的抗体药品①惯用的抗癌药品氨甲喋呤（MTX）、阿霉素（ADM）、丝裂霉素（MMC）等。以人血浆白蛋白作为中间载体，可明显提高每分子抗体所携带的MTX量，使体外细胞毒性体高二倍。②抗体类药品逆转耐药性（3）毒素偶联的抗体药品在导向药品中，毒素和抗体的交联物称为免疫毒素。①第一代免疫毒素是包含有A、B链完整毒素和抗体的交联物，其中B链非特异性结合，使其仅在体外应用。②第二代免疫毒素是运用抗体或抗体片段与毒素的A链或与A链相似的单链核糖体失活蛋白的结合物。因避免了第一代免疫毒素的非特异性，故能在体内有一定的抗肿瘤作用。③第三代免疫毒素重组免疫毒素用基因克隆办法改造毒素基因和小分子抗体基因重组体现。特异性好、稳定性强、渗入性佳、免疫源性低、可大量制备。（3）免疫毒素的临床应用治疗肿瘤、本身免疫病，并能克复组织移植排斥反映，可单独给药也可包裹在脂质体及其它微粒中给药。第五章植物细胞制药第一节基本概念1、植物细胞的全能性。P177植物体中任何一种含有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都能够重新再分化形成原来的个体。第二节植物细胞工程发展简史（略）第三节植物细胞的形态及生理特性1、植物细胞是由细胞壁、原生质体、后含物三大部分构成P1812、细胞壁、质体、液泡三部分是植物细胞特有的构造，动物细胞没有3、植物培养细胞重量的增加重要取决于对数期，而次级代谢产物的积累重要在稳定时（植物细胞培养时期：延迟期、加速期、对数期、稳定时四个时期）4、植物培养细胞的生理特性;P183（1）生长阶段特性延迟期：细胞数量不变，核酸及蛋白合成较快加速期：最大生长久，最大细胞浓度对数期：细胞数呈对数增加稳定时：细胞高液泡化，非常脆弱（2）植物细胞与动物细胞、微生物细胞比较特性哺乳动物细胞植物细胞微生物细胞大小（μm）10~10010~1001~10生长悬浮、贴壁悬浮悬浮营养规定很复杂较复杂很简朴生长速度（倍增时间：h）慢；15~100慢；20~120快；0.5~5细胞分化有有限分化无环境影响非常敏感敏感普通细胞壁无有有产物存在部位胞内或胞外胞内或胞外胞内或胞外产物浓度低低高含水量-约90约75供氧需求1~2520~30100~1000产物种类疫苗、单抗、酶、生长因子、激素、免疫调节剂酶、天然色素、天然有机化合物等发酵食品、抗生素、有机化合物、酶等第四节植物细胞培养的基本技术1、植物材料的准备；P185植物组织培养的外植体必须是无杂菌材料。植物组织培养时表面解决的惯用灭菌剂是次氯酸钙、次氯酸钠、氯化汞。2、植物细胞培养的培养基构成P186（1）无机盐：①大量元素：N,S,P,K,Mg,Ca,Cl,Na②微量元素：Fe,Mn,Zn,Cu,Co,Ni等（2）碳源：糖类，肌醇等；也可直接通过光合作用吸取CO2（3）植物生长调节物质P189①生长素类:吲哚乙酸（IAA）、②分裂素：6-苄基腺嘌呤（6-BA）植物组织和细胞培养物的生长重要取决于生长素和分裂素的比例。高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂，而低浓度生长素和高浓度分裂素刺激细胞生长。（植物激素：指植物代谢过程中形成的生长调节物质，在极低浓度（<1M）时即能调节植物的生育过程，并能从合成部位转运到作用部位而发挥作用。植物激素是现在已发现植物组织中能够形成5种植物激素，即生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯。）（4）氮源：蛋白质水解产物或多个氨基酸。（5）维生素：B族维生素、生物素、肌醇。3、植物细胞大规模培养的办法及特点；P191（1）大规模植物细胞悬浮培养①成批培养法（分批）：最适于植物细胞培养的反映器是气升式反映器将培养基一次性加入反映器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式②半持续培养：在反映器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养基进行家换。③持续培养：运用持续培养反映器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度持续采集细胞和培养液，并以同样速度供应新鲜配演技以使细胞生长环境维持稳定。（2）固定化培养将细胞固定在固定化反映器上（内），放入新鲜培养基中进行培养，或持续流入新鲜培养基，进行持续培养及收集产物，因将细胞固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，易于细胞组织化，易于控制条件和获得较高含量次级代谢产物。第五节影响植物次级代谢产物激积累的因素1、影响植物次级代谢产物积累的因素有哪些？P192（1）生物条件：外植体、季节、休眠、分化等（2）物理条件：温度、光（强度、时间、光质）、通气、PH和渗入压（3）化学条件：无机盐、碳源、生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物质、前体等（4）工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌、培养办法等2、重要影响因素P193（一）外植体选择：不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。（二）培养条件的影响（1）内在因素①接种和诱导：次级代谢产物的产率与外肢体的大小、细胞密度与营养成分有关②培养基的基本构成：培养基的多个成分是愈伤组织和悬浮培养细胞的物质基础，特别是稳定时的次级代谢产物的积累。（磷、氮；铜是次级代谢产物积累的必要元素）③碳源：糖是使用最广、作用最强的碳源，对次级代谢产物影响重要取决于使用的糖种类、糖浓度及另首先级代谢产物的生物合成过程。④植物生长调节剂：不同植物激素及其不同组合形式均可明显影响次级代谢产物的产生。⑤O2和PH：植物细胞正常呼吸需要氧气，因此需要供氧；普通最利于培养植物细胞的PH在5~6⑥渗出物：其它代谢产物也会影响产物产量（2）外在因素①温度:代谢产物产生最佳温度是20~28℃；②搅拌频率：适宜③培养容器④光：光照时间、光质、强度都有影响（三）两步法培养：第一步使用适合细胞生长的培养基（生长培养基），第二步使用适合次级代谢产物合成的培养基（生产培养基）。P197第六节植物细胞培养的生物反映器1、植物细胞反映器的选择取决于：生产细胞的密度、通气量、提供的营养成分的分散程度。P1992、植物细胞大规模培养的生物反映器P201（1）机械搅拌式生物反映器：反映器内温度、PH、溶氧及营养物物浓度易控制。（2）鼓泡塔生物反映器：没有运动部件，操作不易染菌，有较高的热量和质量传递，容易放大，但是流动形式难以拟定，混合不均。（3）气升式生物反映器：低剪切力，混合与氧传递效果好，运动部件不易染菌，操作费用低，但是高密度培养时候混合不够均匀。（4）转鼓式生物反映器：比较适合高密度培养，但是难于大规模操作，放大困难。（5）固定化细胞生物反映器：细胞可长时间重复使用，保护细胞免受剪切力，以实现高密度培养，有助于次级代谢产物合成，易于持续化操作。第七节进展与展望1、植物细胞培养有哪些新进展？P204（1）诱导子在植物细胞工程中的应用：运用诱导子进行有目的次级代谢产物调控及生物合成。（诱导子：植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物攻打的某些次级代谢产物，触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子。诱导子有两种分类，一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子；另一种是根据其来源分为生物诱导子和非生物诱导子。）（2）前提饲喂（3）两相法培养：水相培养的基础上，加入固相或疏水相，形成两相培养系统，从而达成收集分泌物的目的。（4）转基因技术（5）植物生物转化技术与生物制药：生物转化既能够生产新的化合物，又能够改造已有化合物、增加目的产物产量。（生物转化：运用离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行构造修饰而获得有价值产物的生理生化反映）第六章酶工程制药第一节概述1、酶工程：从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将对应原料转化成有用物质的技术。P2162、酶工程重要研究内容是什么？P216（1）酶的分离、提纯、大批量生产及新酶的应用开发。（2）酶和细胞的固定化及酶反映器的研究。（3）酶生产中基因工程的应用及遗传修饰酶的研究。（4）酶的分子改造与化学修饰、以及酶的构造与功效之间关系的研究（5）有机相中酶反映的研究。（6）酶的克制剂、激活剂的开发和应用研究。（7）抗体酶、核酸酶的研究。（8）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。3、现在工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。P2174、应用最广泛的产酶菌：大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、曲霉（黑曲霉和黄曲霉）。P2185、酶法检测可分为：单酶反映、多酶偶联反映、酶标免疫反映。P218第二节酶和细胞固定化1、固定化酶的特点和优点各是什么？P219（1）固定化酶：限制或固定于特定空间位置的酶。（2）固定化酶的特点：既含有生物催化剂的功效，又含有固相催化剂特性。（3）优点：①可多次使用；②反映后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高；③反映条件易控制；④酶的运用效率高；⑤比水溶性酶更适合于多酶反映。缺点：①酶活力有损失②成本增加③只适应可溶性第五，且小分子底物④胞内酶需分离纯化⑤与完整菌相比不适宜多酶反映。2、固定化细胞的特点和优缺点各是什么？P225（1）固定化细胞：将细胞限制或定位于特定空间位置的办法。（2）特点：有细胞特性，现有生物催化剂功效，又有固相催化剂特点。（3）优点：①不必进行酶的分离纯化②保持酶的原始状态，酶回收率高；③比固定化酶稳定性高；④细胞内酶附助因子可再生；⑤细胞本身含多酶体系；⑥抗污染能力强缺点：①副产物多②细胞的壁、膜和载体都存在扩散限制作用③载体的空隙大小影响高分子底物的通透性3、酶和细胞的固定化办法P220（1）载体结正当：将酶结合于不溶性载体上的固定化办法①物理吸附法：用物理办法将酶吸附于不溶性载体（如活性炭等）上的固定化办法。②离子结正当：酶通过离子键结合于含有离子交换基的水不溶性载体上。③共价结正当：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功效团与载体表面反映基团进行共价结合的办法。（2）交联法：用双功效或多功效试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的办法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。惯用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。（3）包埋法：①网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。惯用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。②微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。普通为直径几微米到几百微米的球状体。（4）无载体法（选择性热变性法）：在适宜温度下解决使细胞膜蛋白变性，但酶不变性使酶固定于细胞内。此法只合用于细胞固定化。4、固定化酶的性质（变化）P228（1）酶活力的变化：酶通过固定化之后活力大都下降。（2）酶稳定性的变化：涉及对温度、pH、蛋白酶变性剂和克制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其因素是限制了酶分子之间的互相作用，制止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。（3）酶学特性的变化①底物专一性：对底物的专一性下降。②最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；③最适温度：普通升高。因素是固定化后空间构造更为稳定。④米氏常数(Km)：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。⑤最大反映速度（Vm）：变化很小或不变。6、固定化酶活力测定办法：分批测定法和持续测定法。P231第三节固定化酶和固定化细胞的反映器1、反映器的类型和特点P232（1）间歇式搅拌罐反映器：用于游离酶反映后随即放料。（2）持续流动搅拌罐反映器：持续进料、持续出料（3）填充床反映器：固定化酶填充于床层内。反映器内的流体的流动形态为平推流形。底物以恒定流速通过反映床。（4）流化床反映器：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处在流化状态，达成混合的目的。（5）循环反映器：部分反映液流出和新加入底物流入液混合，在进入反映床进行循环。（6）持续流动搅拌罐-超滤膜反映器（7）其它反映器第四节酶的人工模拟1、人工模拟酶：根据酶的作用原理，用多个办法人为制造的都有酶性质的催化剂。它们普通含有高效和高适应性的特点，在构造上相对天然酶简朴。P2352、主-客体化学和超分子化学是酶人工模拟的重要理论基础。P2363、模拟酶的分类P236（1）根据Kirby分类法：单纯酶模型、机理酶模型、单纯合成的酶样化合物（2）主-客体酶模型：主-客体酶（环糊精CD）、胶束酶模型、肽酶、、分子印迹酶模型、半合成酶4、何谓分子印迹？分子印迹的应用范畴有哪些？P238分子印迹：指制备对某一特定分子含有选择性的聚合物的过程，该特定分子称为印迹分子或模板。分子印迹的应用范畴有：①分子印迹聚合物可作为裁剪分离物质的材料，如手性药品的分离，也能够分离大分子物质。②在酶技术和有机合成中，分子印迹聚合物可作为模拟抗体，模拟酶或含有催化活性的聚合物。③分子印迹聚合物还可在生物传感器的构建中作为传感器，这种聚合物可作为普通使用的生物材料的替代物。第五节酶的化学修饰1、为什么要对酶进行化学修饰?P242酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其它催化剂所无法比拟的。但是，酶是蛋白质，存在其异体蛋白的抗原性、受蛋白酶水解和克制剂作用、在体内半衰期短等缺点，严重影响使用效果。工业用酶经常由于酶蛋白抗酸、碱、有机溶剂变性及抗热失活能力差，容易受产物和克制剂的克制，工业反映规定的pH和温度不总在酶反映的最适pH和最适温度范畴内，底物不溶于水或酶的Km值过高等弱点，限制了酶制剂的应用范畴。酶的化学修饰就是对酶在分子水平上用化学办法进行改造，从而提高酶的稳定性、解除酶的抗原性、变化酶学性质、扩大酶的应用范畴。2、酶化学修饰：通过化学办法对酶分子的主链进行切割、剪接和侧链基团的化学修饰改造，以变化其理化性质和生物活性。P2423、化学修饰的目的：人为地变化天然酶的某些性质，发明天然酶所不含有的某些优良特性甚至发明出新活性，来扩大酶的应用领域，增进生物技术的发展。①提高生物活性②增强在不良环境（非生理条件）中的稳定性③针对异体反映，减少生物识别能力。4、酶化学修饰的办法P243（1）酶的表面化学修饰①大分子修饰：可溶性大分子，如PEG、葡聚糖等通过共价键连接（其中分子量500-0的PEG使用最广）；②小分子修饰：小分子对其活性部位或侧链基团修饰，如氨基葡萄糖等；③交联修饰：双功效试剂如戊二醛等将酶分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部位进行共价交联；④固定化修饰：酶共价连接惰性载体（2）酶分子内部修饰①非催化活性基团修饰：变化酶对特殊底物的束缚能力；②蛋白主链修饰；③催化活性基团修饰；④与辅助因子有关的修饰⑤肽链延伸后修饰（3）结合定点突变的化学修饰：得到新的酶制剂5、修饰酶的特性；P244⑴热稳定性提高；⑵抗各类失活因子能力提高；⑶抗原性消除；⑷体内半衰期延长；⑸最适变化；⑹酶学性质变化：Km会增大，专一性变化等；⑺对组织分布能力变化第六节酶工程研究的进展（有机相酶反映、核酶和脱氧核酶、抗体酶）1、有机相酶反映的定义及其优点是什么？P247（1）有机相酶反映是指酶在含有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反映。（2）有机相酶反映的优点：①增加疏水性底物或产物的溶解度；②热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成等；③可克制有水参加的副反映；④酶不溶于有机介质，易于回收再运用；⑤容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物；⑥酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大；⑦无微生物污染；⑧能测定某些在水介质中不能测定的常数；⑨固定化酶办法简朴，能够只沉淀在载体表面。2、有机相酶反映的溶剂体系各是什么？如何选择溶剂体系和有机溶剂的种类？P248按照溶剂体系的构成和特点，现在有机相酶反映重要有4种溶剂体系。（1）水—水溶性溶剂均相体系：由水和水溶性有机溶剂互相溶解而形成的均一体系。（2）水—水不溶性溶剂两相体系：有机溶剂在水中的溶解度尽量小。在该体系中，规定底物在水和有机溶剂中的溶解度尽量大，而产物在水中的溶解度要小。（3）反相胶团体系：由两性化合物在占优势的有机相中形成的一系列包围水滴的体系。（4）单相有机溶剂体系：在该体系中，不存在单独的水相，只含极微量的水，即在酶分子周边存在着一层水分子膜，以维持催化反映所必需的构象。选择溶剂体系和有机溶剂的种类要根据酶的性质、底物和产物的溶解度及反映器的型式等具体状况而定。3、核酶：（1）剪切性核酶：锤头型核酶、发夹型、丁型肝炎病毒（HDV）核酶、蛋白质-RNA复合酶（RNaseP）（2）剪接型核酶：Ⅰ内含子、Ⅱ内含子；P2504、抗体酶：一种新型人工酶制剂，是一种含有催化功效的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是运用当代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。P252第七章发酵工程制药第一节概述1、发酵工程：微生物工程，运用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术。P2592、发酵工程发展4个阶段：发酵工程发展4个阶段：（1）20世纪前，传统发酵（酒、醋等）（2）1900-1940，揭示发酵本质-微生物引发，诞生许多新的发酵产品（甘油、丙酮等），纯培养技术；（3）发酵大发展，青霉素工业推动发酵，深层培养技术；重要标志有：抗生素、氨基酸、核酸、甾体的微生物转化（4）基因工程应用于发酵；P2