第十一章生物技术

植物生物技术第十一章转基因植物的分子检测及安全评价Goodafternoon第一节转基因植物的检测第二节转基因植物的安全性评价本章主要内容第11章转基因植物的分子检测及安全性评价本章教学目的与要求转基因植物检测方法人们对转基因安全性的几类问题第11章转基因植物的分子检测及安全性评价第一节、转基因植物的检测外源基因是否进入受体植物细胞进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上整合到染色体上的外源基因是否表达能否产生理想的目的表型一、外源基因整合状态检测（一）、PCR检测方法检测报告基因或目的基因快捷、简易、灵敏等优点1.引物的设计与合成2.模板DNA的制备PCR对模板DNA的质量要求不高，可以直接利用细胞裂解液，或用快速微量法（CTAB或SDS法）制备基因组DNA

要有阴性对照和阳性对照83.反应体系与循环参数反应体系：DNA模板，dNTP，TaqDNA聚合酶，buffer反应程序：

变性(94~95oC)

复性

延伸

(37~55oC)(70~72oC)72oC延伸10min30-35cycles

DNA扩增100万倍转基因棉花再生植株的NPT-Ⅱ报告基因的PCR检测M：1Kb的分子量标准；P：质粒；C：非转基因对照；1-27：转化再生植株4.扩增产物检测5.PCR检测的特点：检测迅速灵敏度高，可以检测到纳克级外源DNA操作方便，对DNA质量要求不高不足之处在于假阳性偏高、不能提供整合位点的遗传信息（二）.Southern杂交及拷贝数检测

基因的碱基序列，与含有标记的探针发生同源配对，杂交后能产生杂交印迹或杂交带的转化植株为转基因植株；未产生杂交印迹或杂交带的为非转基因植株选择不同的内切酶和探针组合，根据杂交带的片断大小及数目，可以判断外源基因的插入位点的整合情况及插入的拷贝数1.植物总DNA提取CTAB:十六烷基三乙基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在低盐溶液中，复合物在溶液中沉淀，在高盐溶液中是可溶的，再加入乙醇使核酸沉淀。SDS法：高浓度的SDS在较高的温度下裂解细胞，高盐低温下沉淀多糖及蛋白质，然后用乙醇沉淀DNA2.DNA纯度及浓度的检测：琼脂糖凝胶电泳0.8%

植物DNA呈现分子量较大的清晰条带

如果DNA条带呈弥散状，表明降解如果在小分子量区存在较亮的条带，说明含RNA如果点样孔较亮，表明样品含杂质紫外分光光度法：

OD260/OD260=1.8OD260/OD260>1.8含较多RNAOD260/OD260<1.8含较多的蛋白质及其它杂质3.总DNA的限制性酶切选择合适的限制性内切酶

单酶切酶切反应体系DNA5-15ug体积20-90ul检测酶切效果琼脂糖凝胶分离4.凝胶电泳分离各酶切片段凝胶厚度0.5cm以上样品及上样量含分子量质量标准DNA，阳性对照，阴性对照低电压、长时间电泳1V/CM电泳16小时5.凝胶变性及转膜双链DNA变性成为单链，用0.5MNaOH+1.5MNaCl硝酸纤维素膜尼龙膜毛细管转移法电转移法真空转移法5.预杂交及杂交预杂交：在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点封闭剂：变性的非特异DNA，鲑鱼精DNA

高分子化合物：PVP+BSA+Ficoll400杂交膜在预杂交液中，37-42°温育3-12小时杂交：加入杂交探针，65°保温摇床过夜洗膜：2*SSC—0.1*SSC洗膜6.杂交信号的检测同位素标记的探针通过放射性自显影检测非同位素探针采用酶反应检测转基因棉花再生植株的Southern分子杂交图灵敏度高（可检测1pg的DNA样品），特异性强（可鉴别20个碱基的同源序列）是目前坚定外源基因整合最权威的方法HR16HR18HR19HR24HR26HR30HR35HR37HR38HR39YZ1二、外源基因表达的检测基因表达包括转录和翻译两个水平转录是指以DNA(基因)为模板合成mRNA的过程翻译是指以mRNA为模板合成蛋白质的过程检测外源基因的表达包括特异mRNA和特异蛋白质检测特异mRNA的主要方法是Northern杂交和RT-PCR

特异蛋白质表达的检测方法主要有三种①生化反应检测法②免疫学检测法：Western杂交③生物学活性的检测Northern杂交──DNA和RNA分子之间的杂交检测目的基因是否转录出mRNA的方法（一）、Northern杂交

（二）RT-PCR原理：RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。mRNAcDNAPCR产物RNA提取：逆转录体系：RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、引物（随机引物，OligodT;特异引物)RT-PCR体系：特异性引物、cDNA模板、TaqDNA聚合酶、buffer利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录；观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。

GhUBQ7GhCIPK6Westernimmunoblotanalysisofchitinase(chi)geneexpressioninleafextractoftransgeniccottonlines.（三）、Westernblot（四）、生化反应检测法主要通过酶反应来检测

标记基因的检测（卡那霉素抗性、除草剂抗性）卡拉霉素抗性检测：在转基因植株的顶端刚展开的幼嫩的叶片上涂抹1%（w/v）的卡那霉素水溶液，7天后，观察叶片涂抹部位的颜色反应来判断结果（黄色为敏感、绿色为抗性）ABA，转基因植株叶片B，未转基因株对照（五）、生物鉴定法抗性转基因时，为了测定基因是否转入或者转入的是否表达,可以给转基因植株施加生物胁迫因子,如果产生抗性,表明转基因理想效果；转Bt基因的棉花中,采用抗虫筛选能够最直观地检测到抗虫基因的表达效果BAA，未转基因株对照B，转基因植株叶片本节完一、转基因植物的类型抗病转基因植物：抗病毒转基因烟草抗虫转基因植物：抗虫棉抗逆转基因植物：抗旱、抗盐碱抗除草剂转基因植物：抗除草剂转基因玉米、大豆、棉花、油菜改良品质转基因植物：转VtA水稻转基因药品植物：生产霍乱疫苗的胡萝卜第二节转基因植物安全性评价转基因植物的贡献增加农作物产量降低生产成本减少化学农药对环境的污染改善农作物品质提高经济效益抗除草剂作物转基因植物的生产（图例）抗虫棉花抗CMV病毒转基因番茄抗CMV病毒转基因甜椒转查尔酮合酶矮牵牛花二、转基因产品

安全吗?!转基因生物给人类创造了巨大的经济和社会效益的同时，也可能给人类带来极大的潜在或现实危害。康奈尔大学斑蝶事件加拿大“超级杂草”事件墨西哥玉米事件

1999年5月，康奈尔大学的一个研究组在《Nature》杂志上发表文章，声称转基因抗虫玉米的花粉飘到一种名叫"马利筋"的杂草上，用马利筋叶片饲喂美国大斑蝶，导致44％的幼虫死亡。斑蝶蝴蝶是北美一种珍稀濒危动物，所以在当时在全世界都引起了很大的反响。事实上，这一实验结果在科学上没有说服力。因为试验是在实验室完成的，且没有提供使用花粉量的数据。

现在这个事件也有了科学的结论：

第一，玉米的花粉非常重，扩散不远，在玉米地以外５米，每一平方厘米马利筋叶片上只找到一个玉米花粉。

第二，2000年开始在美国三个州和加拿大进行的田间试验都证明，抗虫玉米花粉对斑蝶并不构成威胁，实验室试验中用10倍于田间的花粉量来喂大斑蝶的幼虫，也没有发现对其生长发育有影响。

斑蝶减少的真正原因，一是农药的过度使用，二是墨西哥生态环境的破坏．有人认为，外源基因的导入可能会造就某种强势生物，从而破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性。1995年，加拿大首次商业化种植了通过基因工程改造的转基因油菜。但在种植后的几年里，其农田便出现了对多种除草剂具有耐抗性的野草化的油菜植株，即超级杂草。如今，这种杂草化油菜在加拿大的草原农田里已非常普遍。因为一些转基因油菜籽在收获时掉落，留在了泥土中，来年它们又重新萌发。如果在这片田地上种下去的不是同一个物种，那么萌发出来的油菜就变成了一种不受欢迎的野草，而且这种能够同时抵御三种除草剂的野草化的油菜不但很难铲除，而且还会通过交叉传粉等方式，污染同类物种，使种质资源遭到破坏。应当指出的是，“超级杂草”并不是一个科学术语，只是一个形象化的比喻，目前并没有证据证明已经有“超级杂草”存在。同时，基因漂流并不是从转基因作物开始，而是历来都有。如果没有基因漂流，就不会有进化，世界上也就不会有这么多钟的植物和现在的作物栽培品种。2001年发现的一种墨西哥玉米基因污染的问题是比较重要的。还有《自然》2001年曾经发表文章，关于墨西哥玉米遭到转基因玉米污染的事件。墨西哥本身不种植转基因的玉米，而且有法规规定不允许种植，但是它进口美国的转基因玉米用做饲料。结果可能是有些农民拿转基因玉米去种，种完之后就污染了当地的玉米。墨西哥是玉米的原产地。如果玉米原产地的遗传多样性受到污染，本地的玉米遗传结构受到破坏，产生的污染问题是很严重的。这件事对中国也有很大的启示。中国现在进口转基因大豆，而中国是大豆的原产地，很有可能转基因的大豆会对中国当地原产的大豆，发生遗传污染。因此，现在国家对转基因的大豆控制还是比较严格，不允许种植。

（一）、食物安全选择标记基因可能编码出对人体有直接毒性的蛋白质；转基因植物可能会表达出过敏蛋白；转基因农作物表达出的某些蛋白质，可能会潜移默化的影响人的免疫系统，从而对人体健康造成隐性的损伤改变农作物品质的基因，可能会改变宿主体内的代谢途径，从而改变转基因食品的营养成分将动物蛋白基因转入农作物中，是否会侵犯素食者或宗教信仰者的权益？把人的某些基因转入农作物或牛、羊等家畜体内，结果在农作物或家畜的肉、耐中含有人的某些蛋白质，这样做是否违反了人类伦理道德？（二）、生物安全1、转基因作物是否会成为“超级杂草”：转基因植物可能会变成野生种类，或者它侵入新的生态区域，破坏了生态平衡后而成为杂草；抗除草剂基因等可能会通过花粉传播或近缘杂交进入到杂草或半驯化植物中，结果产生出超级杂草。2、具有抗虫功能的转基因植物，其体内产生的抗虫蛋白可