第七章 分子发光-荧光与磷光

第七章分子发光光谱法分子荧光:Fluorescence分子磷光:Phosphorescencemolecularluminescenceanalysis§7.1分子发光的基本原理第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。一、荧光与磷光的产生过程

luminescenceprocessofmolecularfluorescencephosphorescence由分子结构理论，主要讨论荧光及磷光的产生机理。1.分子能级与跃迁分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、…电子激发单重态S1、S2…

；第一、第二、…电子激发三重态T1、T2…

；2.电子激发态的多重度电子激发态的多重度：M=2S+1

S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；

S0→T1禁阻跃迁；通过其他途径进入(见能级图)；进入的几率小；

2.激发态→基态的能量传递途径(分子的去激过程)

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转移外转移系间跨越振动弛预无辐射跃迁激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，发光强度相对大；荧光：10-7～10-9s,第一激发单重态的最低振动能级→基态；磷光：10-4～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫分子吸收和发射过程的Jablonski能级图非辐射能量传递过程振动弛豫：在凝聚相体系中，被激发到激发态(如S1和S2)的分子能通过与溶剂分子的碰撞迅速以热的形式把多余的振动能量传递给周围的分子，而自身返回该电子能级的最低振动能级，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间10-12s。内转换：当S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上。这个过程称为内转换。内转换发生的时间约为10-12s。内转换过程同样也发生在激发态三重态的电子能级间。由于振动弛豫和内转换过程极为迅速(10-12s)，因此，激发后的分子很快回到电子第一激发单重态S1的最低振动能级。所以高于第一激发态的荧光发射十分少见。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因此，该过程使荧光或磷光减弱或“猝灭”。系间跨越：是不同多重态之间的一种无辐射跃迁。该过程是激发电子改变其自旋态，分子的多重性发生变化的结果。当两种能态的振动能级重叠时，这种跃迁的概率增大。如S1到T1跃迁就是系间跃迁的例子，即单重态到三重态的跃迁。即较低单重态振动能级与较高的三重态振动能级重叠。这种跃迁是“禁阻”的。

改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。辐射能量传递过程

荧光发射：当分子处于第一激发单重态S1的最低能级时，分子返回基态的过程比振动弛豫和内转化过程慢得多。分子可能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为

’2的荧光；10-7～10-9s。

由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；’2>

2>

1

；磷光发射：激发态分子经过系间跨跃达到激发三重态后，并经过迅速的振动弛豫达到第一激发三重态(T1)的最低振动能级上，从T1态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光发射。磷光发射是不同多重态之间的跃迁(即T1→S0)，故属于“禁阻”跃迁。因此磷光的寿命比荧光要长很多，约为10-3到10s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可以观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。一.分子荧光与磷光的产生1.单重态与三重态2.分子的活化与去活化3.分子发光的类型按激发的模式分类：按分子激发态的类型分类：光致发光化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光

分子发光分子发光荧光磷光瞬时荧光迟滞荧光按光子能量分类：斯托克斯荧光(Stokes)：λex<λem反斯托克斯荧光(Antistokes)：λex>λem共振荧光(Resonance)：λex=λem荧光

分子的活化与去活化S0S1T1S2紫外可见吸收光谱外转移紫外可见共振荧光光谱内转移荧光系间窜跃磷光反系间窜跃迟滞荧光振动弛豫２.无辐射跃迁的类型振动弛豫:Vr10-12sec外转移:无辐射跃迁回到基态内转移:S2~S1能级之间有重叠系间窜跃:

S2~T1能级之间有重叠反系间窜跃:由外部获取能量后T1~

S2１.辐射跃迁的类型共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光:102~10-4sec二.分子荧光(磷光)光谱1.荧光(磷光)激发光谱与发射光谱荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激发光谱和发射光谱。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？A.荧光激发光谱固定

em=620nm(MAX)

ex=290nm(MAX)固定发射波长扫描激发波长荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似

固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。B.发射光谱(荧光光谱)固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线。D.磷光光谱与发射光谱相同条件下的磷光光谱激发光谱发射光谱200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光光谱的特征—激发光谱与发射光谱的关系1、Stokes位移在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激发)光谱的波长长，荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes位移。处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的位移，这种位移表明在荧光激发和发射之间所产生的能量损失。2.镜像对称规则

ex=290nm(MAX)固定

em=620nm(MAX)固定

ex=290nm(MAX)

em=620nm(MAX)S04321S143211→

41→

31→

21→11

→41

→41

→21

→1通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。镜像规则的解释大多数吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构相似，因此吸收光谱的形状与荧光发生光谱的形状呈镜像对称关系。3、荧光发射光谱的形状与激发波长无关一般地，用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程最终回到第一激发态的最低振动能级。而分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级上，所以荧光光谱的形状与激发波长无关。S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间跨越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫分子吸收和发射过程的Jablonski能级图2.三维荧光光谱IF

∝f(λex、λem)蒽的激发光谱固定发射波长、扫描激发波长IF

∝f(λex、λem)蒽的发射光谱固定激发波长、扫描发射波长蒽的三维等高线光谱图蒽的三维等荧光强度光谱VB1和VB2的三维荧光光谱RLSDSTSATSADS散射片三维共振光散射光谱3.三维共振光散射光谱ADSATSTSRLSDS散射片三维共振光散射等高线光谱图共振光散射瑞利散射固定

ex=270nm拉曼光二级共振光散射三级共振光散射荧光光谱有用区间三.分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系1.荧光强度(磷光)与浓度的关系光吸收定律（Lambert–BeerLaw）相应的吸光分数为：荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：按照级数展开式：对于稀溶液，当bc<0.05（磷光bc<0.01）时：IF----荧光强度

F-----荧光量子产率k--与仪器灵敏度有关的参数I0--入射光强度。IP----磷光强度

P-----磷光量子产率b--吸收光程

--摩尔吸光系数C--荧光物质浓度2.荧光(磷光)的平均寿命分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来的1/2所经历的时间。对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均寿命()可以左式表示：

3.荧光(磷光)的量子产率荧光量子产率的定义：kF、kp主要取决与荧光物质的分子结构；

st系间窜跃效率。

ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，

F=0.55；

荧光素

F=1化合物

F0.110.290.460.600.521.跃迁的类型二.荧光与有机化合物的结构对于有机荧光物质:π*

→πn→π*εmax＜100平均寿命10-5~10-7secπ→π*

εmax≥104平均寿命10-7~10-9seckS→T小π*→nπ*→π是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。强荧光的有机化合物具备下特征:①具有大的共轭π键结构；②具有刚性的平面结构；③具有最低的单重电子激发态为S1为π*

→π型；④取代基团为给电子取代基。§7.2分子荧光与磷光强度的影响因素一.荧光的量子产率——分子结构和发光分子所处的环境2.共轭效应产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580λemmax

(nm)278321400480640

F0.110.290.460.600.52荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。3.刚性平面结构芴联苯

F=1

F=0.2不产生荧光产生荧光产生荧光不产生荧光

F=0.92萘VA

F(萘)=5

F(VA)

荧光黄酚酞偶氮菲偶氮苯1）给电子取代剂加强荧光4.取代基效应—HN2，—NHR，—NR2，—OH，—OR，—CN产生p→π共轭二苯甲酮：弱荧光、强磷光S1→T1的系间窜跃产率接近1化合物苯苯酚苯胺苯基氰苯甲醚λemmax(nm)278~310285~365310~405280~390285~345相对荧光强度10182020202）得电子取代基减弱荧光、加强磷光—C=0，—COOH，—NO2不产生p→π共轭硝基苯：不产生荧光、弱磷光空间位阻对荧光发射的影响3）取代基的位置反式二苯乙烯强荧光物质

F=0.75

F=0.03立体异构体对荧光发射的影响顺式二苯乙烯非荧光物质电离效应对荧光发射的影响OH-H+OH-H+pH=1,有荧光pH=13,无荧光无荧光有荧光含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。5.重原子取代基效应—Cl，—Br，—IS1→T1的系间窜跃由于重原子的存在增强化合物萘1-甲基萘1-氟萘1-氯萘1-溴萘1-碘萘λFmax(nm)315318316319320~λPmax(nm)470476473483484488

P/

F0.0930.0530.0685.26.4>1000τ

p(s)2.62.51.40.230.0140.00236.溶剂效应蓝移:△

En→π*

＜△

En→π*红移:△

Eπ→π*

＞△

Eπ→π*在极性溶剂中：无溶剂化作用有溶剂化作用三.金属螯合物的荧光1.螯合物中配位体的发光2.螯合物中金属离子的发光8-羟基喹啉弱荧光8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光2,2`-二羟基偶氮苯无荧光2,2`-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光T1系间窜跃S0S1d*、f*d*→

df*→

f荧光分子内能量转移三、影响荧光强度的环境因素1.溶剂的影响

除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；2.温度的影响荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。3.溶液pH

对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4.内滤光作用和自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；5.溶液荧光的猝灭荧光熄灭：荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。荧光熄灭剂：这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光熄灭剂。1.碰撞熄灭相对速率1K1[M*]K2[M*][Q]与分子的直径、粘度、温度等因素有关。2.能量转移熄灭再吸收过程：共振能量转移：分子内能量转移：hv激发发射熄灭3.氧的熄灭作用氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，4.自熄灭与自吸收当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭(浓度熄灭)自吸收：没有除氧，溶液中难以观察到磷光由于

F<1，使荧光强度减弱或消失.形成二聚体：由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。§7.3荧光(磷光)分光光度计一.主要组成及部件的功能荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图光源氙灯激发单色器样品池光电倍增管数据处理仪器控制光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器发射单色器问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？二.光源1.光源的要求：发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命2.氙灯光源常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源波长范围：200~1000nm工作压力：5~20atm启动电压：20~40KV使用寿命：1000~2000h最广泛应用的连续光源：发射波长范围宽发射光强度大3.高压汞灯光源应用广泛的线光源：253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0(nm)光源样品池激发滤光片检测器数据处理仪器控制发射单色器光源样品池激发滤光片检测器数据处理仪器控制发射滤光片玻璃滤光片的透射率干涉滤光片的透射率截止涉滤光片的透射率三.单色器平面衍射光栅线色散率聚光本领分辨率四.检测器光电倍增管放大倍数：2n~5n;n=10,103~107，最大108~109五.样品池：液池、荧光池1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样2.吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光波长范围3.使用注意事项容易破碎问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？沾污问题闪跃特性六.磷光分光光度计1.光学系统与荧光分光光度计的区别光源样品池激发单色器检测器数据处理仪器控制发射单色器切光器（斩波器）共振荧光：10-12sec荧光：10-8sec磷光：1~10-4sec迟滞荧光：100~10-4sec2.样品池与荧光分光光度计的区别通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。§7.４荧光分析法的应用一.工作曲线法荧光分析的灵敏度比紫外－可见分光光度法高103～104.荧光熄灭工作曲线法FxFCsCx直接荧光标准曲线法FCsFxCx二.荧光分析法的灵敏度在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。三.荧光分析的应用1.无机化合物直接荧光测定法其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到1