基于表面等离子体共振传感器的生物传感器核酸检测方法

基于表面等离子体共振传感器的生物传感器核酸检测方法

在空间任务的执行过程中，由于辐射和反应等因素的综合影响，公民的免疫功能得到降低，探测器的湿热环境适合于微生物的生长和繁殖。因此，航空航天环境中的微生物对驾驶员健康和载人飞机系统的可靠性有更大的威胁。目前航天环境的微生物检测仍以在空间对环境进行样品采集,任务结束后返回地面对微生物进行鉴定为主,检测过程滞后,无法对航天器内的微生物污染及时采取相应的处置措施,影响航天员的健康及航天任务的顺利完成。如能实时、在线对航天环境的微生物进行准确的检测,对确保航天员的健康及工作效率具有极其重要的意义。目前生物传感器技术凭借其实时、灵敏、快速的特点应用广泛,是建立空间实时微生物检测系统的可选方法之一。其中,表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技术作为一种无需进行样品标记、能够实时监测生物分子之间相互作用的光学检测方法,近年来发展迅速。该方法样品用量少,灵敏度高,抗干扰能力强,在核酸杂交、遗传病诊断、基因突变研究及微生物检测等领域得到广泛的应用。本实验中应用以SPR生物传感器为技术核心的便携式生物分子在线分析系统(portableonlinebio-moleculesanalyzer,POBA),通过将巯基修饰的寡核苷酸固化于传感器表面作为探针分子,对溶液中的靶序列进行检测,并通过对该检测方法的灵敏度、特异性、重复性等进行研究,为SPR生物传感器技术应用于微生物的实时、在线检测提供依据。探针分子膜的制备和检测仪器POBA系统构成图见文献。试剂6-巯基-1-己醇(6-mercapto-1-hexanol,MCH)购于Sigma-Aldrich,其余试剂购于北京化学试剂公司,实验中所用溶液组成如下:固化溶液,KH2PO41mol/L;杂交缓冲液,NaCl150mmol/L,Na2HPO420mmol/L,EDTA0.1mmol/L;再生溶液,HCl0.5mol/L。寡核苷酸序列合成于北京赛百盛基因技术有限公司。探针序列,5’-HS-T18-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’;互补寡核苷酸,5’-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3’;非互补寡核苷酸,5’-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。核酸分子膜的制备通过探针分子5’末端的巯基与传感器金膜形成的硫-金共价键,完成探针分子在金膜表面的固化。1)传感器金膜放入4%SDS中浸泡10min,将棉签浸湿后轻轻擦拭金膜表面,纯净水冲洗后晾干。2)将传感器置于支架上,使金膜处于水平位置,吸取100μl探针溶液(1μmol/L,固化溶液配制)滴于金膜表面并使之铺平,室温湿盒中固化2h,纯净水清洗后滴加100μl1mmol/LMCH(纯净水配制)于金膜表面,封闭传感器表面的空余位点。核酸样品检测待测序列溶液恒速流经传感器表面,与探针分子发生杂交反应,具体步骤如下:1)待测序列溶液(杂交缓冲液配制)注入检测池5min;2)注入杂交缓冲液3min清洗测试面,以除去未结合的寡核苷酸分子。传感器再生注入0.5mol/LHCl30s,使杂交双链解聚,完成探针分子的再生,进入下一个检测循环。整个反应过程在室温(25℃)下进行,溶液注入通过蠕动泵完成,流速控制在60μl/min,所检测到的信号,称之为折射率(refractiveindex,RI),杂交反应前后的RI差值代表传感器表面结合靶序列的量。传感器检测限应用传感器表面固化的探针分子,按照碱基互补配对原理检测溶液中的靶序列,靶序列与探针结合后表现为折射率值的升高,结合靶序列的质量与折射率的变化值正相关。传感器特异性应用1μmol/L非互补寡核苷酸溶液作为阴性对照进行杂交,非互补核酸序列与传感器表面探针无结合,引起的RI变化值可忽略(低于1.0×10-5)。传感器检测限将互补靶序列溶液倍比稀释,浓度分别为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125nmol/L,然后依次将样品注入流通池进行检测,所得的浓度-折射率曲线如图1所示。从图2中可见,该曲线在0～62.5nmol/L浓度范围内呈线性分布,计算所得的最低检测限为2.3nmol/L(对空白溶液进行≥3次检测,计算3次结果的标准差,以数值的3倍为纵坐标,曲线中所对应的横坐标浓度值即为最低检测限)。传感器重复性与稳定性应用相同浓度(1μmol/L)互补靶序列进行9次检测,所得RI结果的平均值为(10.52±0.37)×10-5,变异系数CV为3.5%。为了验证该核酸传感器的稳定性,应用相同浓度(1μmol/L)互补靶序列重复进行30次检测,将测试中靶序列与探针的杂交时间缩短为3min,所得RI结果的平均值为(7.84±1.16)×10-5,变异系数CV为14.7%。传感器表面固化目前SPR技术应用于微生物检测领域主要针对特异性表面抗原,易受到微生物表面抗原变异的影响;而微生物基因组16SrDNA中的保守序列较为稳定,变异程度低,在微生物诊断及种类鉴定方面具有优势。本实验中选用的探针是真细菌16SrDNA中的保守片段,以求应用于下一步的微生物检测工作。探针固化是实验的关键环节,本实验中将探针的5’端进行巯基化修饰,通过该巯基与传感器金膜形成硫-金共价键从成固化;一种探针固化方法也将传感器的表面预先进行葡聚糖修饰,依次将链霉亲和素(streptoavidin)及生物素(biotin)化的探针与传感器进行交联,完成探针的固化。该两种固化方法均可获得适宜的探针密度,杂交反应结果理想,但后者程序较复杂,影响因素较多,操作时间长,故本实验中采用巯基修饰探针的固化方法,直接简便,利于控制实验条件。在传感器表面进行寡核苷酸探针的固化通常存在2种问题:1)探针在传感器表面呈平铺状态;2)互补靶序列在固相杂交中的空间位阻。固化过程中,探针分子链较长,则探针分子通过5’末端巯基固化的同时,探针链上的氨基也可与金膜形成微弱的化学键,使探针分子在金膜表面形成平铺的状态,不利于靶序列与探针分子的杂交。实验中应用MCH封闭金膜表面空闲位点,该小分子与金膜形成稳定的硫-金共价键而取代探针与金膜形成的微弱化学键,使探针分子在金膜表面呈直立状态而更有利于杂交反应。探针合成过程中在巯基及探针序列间加入了18个T碱基,通过增加探针分子的长度,维系靶序列与探针分子杂交所必需的空间,又有效地增加了探针杂交部位与金膜表面的距离,降低了靶序列与金膜之间的空间位阻,更有利于靶序列与探针的杂交反应。poba的系统特征本实验建立的检测方法分析时间短,靶序列样品检测可在15min内完成;灵敏度高,检测下限可达2.3nmol/L,与国外实验室的10nmol/L检测下限有较大程度的提高;特异性强,与非互补序列杂交无折射率的变化,单碱基错配序列(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3’)与探针杂交,引起折射率的变化值仅为完全互补序列与探针杂交后折射率变化值的78.6%(结果未显示),表现出较高