gf-对小鼠股骨骨折修复作用的实验研究

gf-对小鼠股骨骨折修复作用的实验研究

长期以来，从骨折愈合过程中观察到了骨的代谢，即骨的形成、吸收和重建过程，逐渐认识到这种代谢过程中各种活性物质的调节。近年来发现,骨生长因子缺乏或活性不足是延迟骨折愈合及至骨不连接的重要原因。因此,如何促进骨折、骨缺损的修复,治疗骨不连是骨科领域积极探索的课题。为了进一步观察骨转化生长因子—β(TGF-β)的成骨能力及作用机理,我们用新鲜小牛血小板提取出TGF-β,进行骨折治疗的实验研究,为临床应用打下基础。1材料和方法1.1血小板蛋白的分离纯化以新鲜牛血小板为原料,参照Assioan等的方法,采用酸醇抽提方法,提取血小板蛋白,并先后经这两次BioGelP60柱层析,分离纯化,并与标准TGF-β比较,纯度达98.7%。以NRK细胞和肌内包埋,测定活性,冻干后低温保存。(方法另发表)1.2小鼠骨折动物模型及注射取昆明小鼠80只,雌雄各半,体重18～20g。每只小鼠右后肢股骨定点制成骨折动物模型,并外固定,随机分为A、B、C、D四组,每组20只。每日在A、B、C三组小鼠骨折处骨膜下注射药液25μL,连续注射10天,D组空白对照。A组注射TGF-β10μg/d,B组注射5μg/d,C组注射PBS。1.3观察指标1.3.1x线检查术后7、14、21天四组动物分别在48kV,25mA,0.12S,50cm的投照条件下进行X线摄片,以观察骨折修复过程和效果。1.3.2小鼠骨髓矿物的he染色术后7、14、21天各组随机杀死5只实验小鼠,取下右侧股骨10%甲醛固定,混合脱钙液脱钙,逐级脱水,石蜡包埋,作5μm切片,HE染色,光镜观察。1.3.3平均体积密度和数量密度在HE染色切片上,取外骨痂远、中、近3个视野,利用微机图像处理系统处理切片图像,分别计算出骨折后7、14、21天骨痂内骨生成细胞、成骨细胞的体积密度(Vˉvt),平均体积(Vˉv),数量密度(NˉV),并经统计学处理。2结果2.1骨折超早期感染的动物伤tgf-5g/d术后14天,A组(TGF-β10μg/d)动物右下肢骨折处已有明显骨性骨痂形成,局部增粗,骨密度较高,骨折线不清,但断端骨髓腔未通。而B组(TGF-β5μg/d)在骨折处仅见纤维性骨痂,骨痂密度较低,骨折线清楚可见。C组(PBS组)和D组(空白对照组)动物伤肢局部软组织肿胀明显,未见有骨痂形成,断端无骨连接,骨折线清楚。术后第21天,A组动物伤肢已完全愈合,骨折线消失,断端骨髓腔再通,骨皮质厚度与健侧完全相同。B组动物伤肢局部已形成了骨性骨痂,但骨髓腔未通。C组、D组动物伤肢局部仅生有大量纤维性骨痂,密度较低,断端清楚可见,未愈合(图1～3)。2.2术后骨部的充填A组动物术后7天,外骨痂中含有较多的成纤维细胞和纤维性结缔组织及新生的毛细血管,骨生成细胞数量较多,呈群存在;位于幼稚骨小梁边缘有众多呈层排列的成骨细胞。术后14天,骨小梁进一步成熟,呈网状或海绵状,功能活跃的成骨细胞、成纤维细胞与功能活跃的破骨细胞同期发挥作用,进行内外骨痂塑建和改建,部分骨小梁被吸收。术后21天,内外骨痂改建、塑建进一步完善,骨髓腔已通,骨折线消失,骨折被修复。B组动物至第三周,内外骨痂处于塑建和改建阶段,骨髓腔未通。C组、D组在骨折处有大量纤维组织和丰纤维细胞,仅见大量成骨细胞,断端依然明显。2.3不同时期内骨细胞的体积密度v.vt、平均体积v.v和数量密度n的统计结果如表1和表2所示从表1中可见,骨生长细胞Vvt给药后1～3周对照组大于实验组,Vv、Nv第1～3周实验组大于对照组。3骨转化生长因子-一旦发生骨折,在断端部位很快就出现纤维组织增生,血管增加,细胞分裂,增殖活跃。这种骨的再建过程受着体内多种活性物质的调节,同时也受着骨和软骨内含有的多种生长因子的调控。经研究证明,骨和软骨组织内含有的生长因子,是由骨和软骨细胞产生,并贮存在骨基质中,在一定条件下可被释放或激活。它们作为局部调节因子,以自分泌或旁分泌的方式调节着骨和软骨内各种细胞的增殖与分化,调节骨和软骨基质的合成与降解促进骨折区的血液循环、毛细血管增生,加强DNA、I型胶原和非胶原合成,刺激骨细胞和软骨细胞的增生,抑制破骨细胞性骨吸收,加快骨折或骨缺损的修复。骨转化生长因子-β之所以能发挥其生物活性,是由于受受体介导的。在骨和软骨细胞膜上存在着与各种生长因子相对应的特异性受体,尽管有些生长因子有多种形式,但它们都分别作用于各自的一种受体。在骨和软骨内,生长因子受体在细胞上分布较广,几乎所有的细胞均含有一种或数种生长因子的特异性受体。这些受体对相应的生长因子有高度亲合力,当血液中某一种生长因子浓度增加,就会在相应受体介导下到达受伤处,广泛参与骨再建的局部调节作用,促进骨折修复。当前,将骨生长因子作为促进骨折和骨缺损的修复,用于受累的前成骨细胞,以加强其增殖及功能恢复,是很有应用前景的。据报道局部应用1