山药多糖的提取分离与测定

山药多糖的提取分离与测定

山药是甘薯科植物甘薯的干燥根茎。具有益脾健脾、益肾益精的功效。主要治疗脾虚腹泻、长大便、虚证咳嗽、口渴、精子减少、排尿次数等症状。以往对山药多糖的提取分离大多采用水提取,乙醇沉淀法和Savege去蛋白法得到较为纯化多糖,并且含量测定通常采用紫外分光光度法。本实验采用水提取,乙醇和十六烷基三甲基溴铵盐(CTAB)沉淀法,从山药中分离纯化得到多糖,并进行了相对分子质量的测定;采用HPLC法测定了山药总多糖含量,现报道如下。1药物、药物和生药学试剂DIONEXUltimate3000高效液相色谱仪,包括脱气机、高压泵、自动进样器、柱温箱、示差检测器、色谱工作站;凝胶柱为Phenomen的Luna5uC18100A(150mm×4.60mm);凝胶层析柱SephadexG-100(Pharmacia公司,3×100cm玻璃柱,床体积为500mL);葡萄糖(上海化学试剂公司);CTAB(十六烷基三甲基溴胺盐,Pharmacia公司);标准葡聚糖(dextran,中国药品及生物制品鉴定所);山药购自十堰市天宁医药公司,并经本科室马都文老师生药学鉴定为DioscoreaoppositaThunb.;乙腈为色谱纯;无水乙醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为分析纯。2方法和结果2.1生化法检测多糖药材粉碎后,用8倍量水煎4h,过滤,药渣同法再煎1次,两次滤液合并,浓缩液以95%乙醇沉淀,离心分离得醇溶部分(Dr.1)和醇沉部分(Dr.2)。Dr.2用水溶解,离心除去不溶物,溶液用1%CTAB溶液沉淀,上清液以两倍95%乙醇沉淀,所得沉淀经水溶后再沉淀,冷冻干燥得到中性多糖部分,记为NDT;CTAB沉淀用4mol·mL-1氯化钠溶解,离心除去不溶物,适当浓缩后95%乙醇沉淀,沉淀经冷冻干燥得到酸性多糖,记为SPT。NDT和SPT经紫外检测280nm无吸收,说明基本无蛋白类成分,NDT经SephadG-100凝胶层析(洗脱剂为水,流速为20mL·min-1),苯酚-硫酸法检测,合并主要吸收峰馏分,冻冻干燥得纯化多糖S1和S2。凝胶层析图见图1。2.2标准曲线的绘制2.2.1总多糖相对分子质量的测定由标准Dextran(相对分子质量分别为57200,43000,21400,17500,50Dal)的分子量对数与保留时间求得标准曲线,得回归方程为:lgM=7.10-0.25t(r=-0.993),按同样条件测定样品S1和S2的保留时间,由回归方程求得样品S1和S2的相对分子质量,相对分子质量分别为62000和7300Dal。2.3测定了山芝糖的总含量2.3.1动相、缓冲液、理论塔板的制备C18100A色谱柱(150mm×4.60mm);流动相:乙腈、磷酸盐缓冲液(70∶30);流速:1.5mL·min-1;检测波长:210nm;进样量:20μL;理论塔板数:2500。对照品及总多糖的色谱图见图2。2.3.2标准溶液的配制精密称取葡萄糖对照品125mg,置50mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀。精密量取2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL分别置10mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。各取溶液20μL分别注入色谱仪,记录色谱图,由峰面积(A)对溶液浓度(C)线性回归,得回归方程(n=5):A=100386C-6048,r=0.9996,葡萄糖在0.5～1.5g·L-1范围内呈线性。2.3.3加样回收率的测定精密量取已知含量的样品5mL,精密加入1g·L-1的葡萄糖对照品1mL,按含量测定方法项下制备所需溶液,并进行测定,计算回收率。经实验测得平均回收率为93.26%,RSD为1.02%(n=5)。2.3.4精密度测试在选定的色谱条件下,取已知含量的样品溶液连续进样5次,按峰面积计算RSD为0.83%。2.3.5稳定性试验取样品按含量测定方法,每隔1h测定1次,在12h内溶液稳定,按峰面积计算RSD为1.2%。2.3.6标准品溶液的制备用微量移液器吸取山药总多糖300μL于具塞离心管中,加无水乙醇600μL,盖上塞子后充分振摇,置高速离心机以14000r·min-1离心5min,取上清液用0.45μm滤膜滤过,以续滤液作为供试品溶液。精密量取20μL注入液相色谱仪;另取葡萄糖对照品用水制成每1mL含葡萄糖1mg的溶液,作为对照品溶液,同法测定,按外标法计算,结果山药总多糖的含量为16.42%,RSD为0.09%。3蛋白和活性化合物的分离纯化本实验采用水提取,乙醇和十六烷基三甲基溴胺盐(CTAB)沉淀法,对山药中的多糖进行了初步分离,从山药中分离纯化得到多糖,得到两个多糖S1和S2,全水解产物的分析表明,它们的糖组成均为葡萄糖,HPLC分析显示它们为均一多糖,相对分子质量测定结果分别为62000和7300Dal。采用十六烷基三甲基溴铵盐(CTAB)沉淀法除去蛋白和SephadexG-100柱层析可以得到纯度较好的多糖。本实验收集到的多糖S1和S2由于量少而无法再做进一步的结构分析,若需要对其进行分析则须大量制备,此工作可以在以后开展。本实验曾采用过乙腈、水的流动相,并与乙腈、磷酸盐缓冲液的流动相作比较,经实验发现采用乙腈、磷酸盐缓冲液(70∶30)为本品含量测定的流动相,所得峰形较好,