肝细胞生长因子对后路固定大鼠腓肠肌细胞凋亡的影响

肝细胞生长因子对后路固定大鼠腓肠肌细胞凋亡的影响

肝生长因子（hgf）是间质细胞产生的一种多功能因素。它可以调节细胞的生长和运动，对胚胎、组织的生长、肝脏和肾脏的再生、肿瘤的转移和损害的修复起着重要作用。近年来,有学者发现HGF也是已发现的促卫星细胞生长因子中唯一能激活静止期卫星细胞的生长因子,能使处于静止期的骨骼肌卫星细胞退出G0期,进入S期开始分裂,比其它生长因子的增殖作用更为明显更适合于临床。本实验旨在观察HGF对大鼠后肢固定后腓肠肌超微结构、骨骼肌细胞凋亡的影响,探讨其对骨骼肌废用性萎缩恢复的作用机制,为今后的理论研究和临床治疗提供依据。1材料和方法1.1动物饲养与使用雄性Wistar大鼠24只(200～250g),由南方医科大学实验动物中心提供,随机分为正常对照组、模型组和实验组,每组各8只,均在同一实验室饲养,按照南方医科大学实验动物饲养与使用规定进行。将模型组、实验组按照Jozsa等的方法,将大鼠右后肢用可塑性石膏由足跖管型固定至膝上1cm处,膝关节固定于屈曲位100°,踝关节固定于跖屈60°,以使小腿肌肉保持松弛位。实验组于制动当日起将肝细胞生长因子(HGF,广东阳江制药有限公司)按大鼠体重10mg/kg溶于1ml生理盐水注射入大鼠腓肠肌,每天1次,模型组注射等量生理盐水,正常对照组不做任何处理。四周后,由肌肉的起点至止点完整取出大鼠右后肢腓肠肌,进行相应指标检测。1.2骨骼肌细胞凋亡和bcl-2单克隆抗体的检测各组织标本以多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、HE染色,光镜观察;电镜标本以30g/L戊二醛-10g/L锇酸双重固定,环氧树脂包埋,超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅电子染色,透射电镜观察;骨骼肌细胞凋亡的测定采用DNA末端原位标记法(TUNEL法,试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司),严格遵照试剂盒说明书实验步骤进行操作,最后显微镜下控制显色,中性树脂封片。于400倍光镜下观察,凋亡骨骼肌细胞的胞核呈深浅不一的棕黄色;bcl-2单克隆抗体的测定采用免疫组化染色法(免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司),染色模式为胞质或胞膜,于200倍光镜下观察,棕黄色颗粒表达为bcl-2阳性细胞;每张切片取相邻10个视野,计数10个视野的阳性细胞数量,取其平均数作为每个切片的阳性细胞数(两种方法样本量均为每组8张切片)。1.3统计处理数据处理使用spss10.0。所有数据均以x¯±sx¯±s表示,多组间两两比较用t检验。2结果2.1he染色光显微镜观察模型组肌纤维排列紊乱并伴有胶原纤维瘢痕形成;实验组肌纤维再生比较完全,基本未见纤维瘢痕。2.2超微结构电镜观察模型组可见肌浆网扩张,线粒体肿胀、空腔化;实验组线粒体基本无肿胀,空腔化少,肌浆网扩张少。2.3各组阳性细胞凋亡的比较TUNEL法在正常对照组中偶见散在凋亡骨骼肌细胞,模型组凋亡肌细胞呈强阳性表达,细胞核呈深浅不一的棕黄色,实验组较模型组明显减少(图1:A为模型组、B为实验组,见封3)。实验组、正常对照组和模型组的阳性细胞凋亡数分别为20.38±1.92、8.25±1.67、31.5±2.45。将实验组分别与正常对照组和模型组进行统计学比较,P<0.01,可以看出实验组与模型组的阳性凋亡细胞数值的差异有显著性,具有统计学意义;bcl-2单克隆抗体在正常对照组偶有表达,实验组呈强阳性表达,模型组较实验组表达明显减少(图2:A为模型组、B为实验组,见封3)。实验组、正常对照组和模型组的阳性细胞凋亡数分别为41.88±2.03、21.5±2.07、13.25±2.05。将实验组分别与正常对照组和模型组进行统计学比较,P<0.01。因此,实验组和模型组的阳性细胞表达数量的差异具有显著性,并具有统计学意义。3hgf对废用性肌凋亡的调节作用肢体制动是骨关节病损的一种主要治疗手段,由此带来的骨骼肌废用性萎缩严重的影响了疾病的治疗和功能的恢复,在某些情况下其危害性甚至超过了原发病。如何迅速地缓解肌肉萎缩,恢复运动能力,有着重要的理论和实践意义。近年来人们在对骨骼肌的萎缩与细胞凋亡之间关系的研究中,发现细胞凋亡可能在骨骼肌萎缩过程中起着重要的表达作用。Tews指出,随着制动时间的延长,凋亡的骨骼肌细胞数显著增加,即使解除制动,要想完全康复到原有水平也极为困难。与凋亡有关的基因有bcl-2基因家族、Ced基因/ICE等基因家族,其中Bc1-2基因位于线粒体膜或核膜及溶酶体膜,其作用是抑制多种原因引起的细胞凋亡。Bcl-2的高表达有助于维持肌细胞的存活,持续增加的Bc1-2高表达可对抗Bax促进凋亡的作用,而且Bc1-2还可作为反映骨骼肌萎缩预后的重要标记物。本实验的主要目的是观察HGF在废用性肌萎缩预防与治疗中的作用,所以我们在制动的当天便开始进行干预治疗,而且其在临床的毒副作用较小,适合临床长期使用。结果表明,实验组大鼠骨骼肌中Bcl-2基因的表达明显高于模型组,而肌细胞凋亡数却明显低于模型组,结合电镜、光镜所观察到的骨骼肌超微结构的改变,说明HGF能够促进骨骼肌的再生,有效的抑制废用性肌萎缩的发生。这可能与HGF激活位于细胞外间质的基板膜以及肌纤维浆膜上的卫星细胞有关。卫星细胞在通常情况下是静息状态的单核干细胞,被激活后会增生,相互融合成多核肌管代替损伤的肌纤维,这一过程伴随着激活生长因子和酪氨酸蛋白激酶等蛋白酶的释放,这些生长因子和蛋白酶以不同的方式作用于单核神经细胞、细胞外基质,以及血管再生重塑等过程。在促使血管再生及随后的肌肉再生分化过程中发挥重要的作用。而酪氨酸蛋白激酶(PKC)介导的一系列复杂的生化过程抑制凋亡基因的转录表达,诱导或激活凋亡抑制基因的表达,如Bc1-2基因等的表达,从而抑制了细胞的凋亡。HGF对骨骼肌卫星细胞增殖周期进行调控的特性,给我们在废用性肌