大鼠右后路坐骨神经切除的实验研究

大鼠右后路坐骨神经切除的实验研究

坐骨神经不仅用于下肢骨骼的代谢，还用于长入骨骼的组织。这些神经纤维结构包含各种神经纤维。现在，在成骨细胞膜表面发现这些神经纤维受体。神经递质P物质在直径很小的初级传入神经中合成,并从末梢神经终端释放。目前研究证实神经递质P物质可以促进与破骨细胞有关的骨吸收,但其作用机制仍不清楚。1材料和方法1.1动物模型的生产1.1.1实验动物和饲料10月龄雄性Spragne-Dawley大鼠40只,体质量200～300g,购于山西医科大学动物实验中心,饲养于通风透光的环境下,摄食自来水和标准大鼠饲料。饲料由山西医科大学动物中心生产并提供。1.1.2小鼠坐骨神经损伤模型随机将大鼠分为2组,每组20只,分别为对照组(伪手术组)和实验组(坐骨神经切断组)。对照组行大鼠右后腿坐骨神经伪手术,实验组将大鼠右后腿坐骨神经切除1.00cm,制造废用性骨质疏松模型。大鼠用10%水合氯醛以3mL/100g体质量行腹腔麻醉后,沿右臀部及右后腿后侧备皮后俯卧位固定于手术台。安尔碘消毒右大腿及臀部,触到股骨大转子及坐骨结节后,在两体表标志中间行长约2cm纵行切口,在半腱肌、半膜肌和股二头肌之间找到坐骨神经,在梨状肌下缘处切除坐骨神经1.00cm,然后缝合皮肤切口。对照组只分离显露坐骨神经后缝合切口。最后皮下注射青霉素10万U,连续用3d。1.1.3小鼠骨髓组织刮刮分别于术后6、12周将SD大鼠用水合氯醛3mL/100g体质量剂量进行腹腔麻醉,然后将大鼠处死。取右侧股骨,用自制刮匙将骨髓组织小心刮出备用,冷冻保存;然后剔除软组织。将股骨用5%戊二甲醛4%多聚甲醛混合固定液(多聚甲醛2mg,蒸馏水25mL,1mol/LNaOH1～3滴,25%戊二醛10mL,依次加入后,加0.2mol/L磷酸缓冲液至50mL)固定24h。1.2不同浓度酒精的精准提取液、本工液、国白素-内源性过氧化物酶活性检测①大鼠术后6、12周分别取股骨,5%戊二甲醛4%多聚甲醛混合固定液固定24h。5%乙二胺四乙酸(EDTA)-Na2液(pH<7.2)脱钙3个月,每3～4d换液1次,脱至可用针刺入骨组织为止。梯度酒精脱水24h,石蜡包埋。②石蜡切片,烤箱干烤2h脱蜡;梯度酒精脱水:二甲苯(20min)—二甲苯(20min)—100%酒精(10min)—95%酒精(10min)—85%酒精(5min)—70%酒精(5min)蒸馏水冲洗,磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5min(如需采用抗原修复,在此步骤后进行)。3%H2O2去离子水,无色液体孵育5min,以消除内源性过氧化物酶活性。滴加山羊血清工作液,室温孵育10min。滴加1∶100比例稀释的一抗,4℃孵育过夜。PBS冲洗,5min×3次。滴加二抗,室温孵育10min。PBS冲洗,5min×3次。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,室温孵育10min。PBS冲洗,5min×3次。二氨基联苯胺(DAB)显色剂显色。自来水充分冲洗。③苏木素轻度重染—梯度酒精脱水—二甲苯透明—中性树胶封片。采图后用IDA-2000图像自动分析系统进行分析。1.3统计处理采用t检验。2组患者opg、rakenl在实验组中表达情况免疫组织化学检测骨保护素(OPG)及核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达结果:OPG及RANKL阳性表达定位于胞质,呈棕黄色,表达部位在成骨细胞。术后6周,OPG在对照组中表达呈强阳性(0.185±0.006),而在实验组中表达呈弱阳性(0.151±0.003),差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周,OPG在对照组中表达呈阳性(0.176±0.019),在实验组中表达也呈阳性(0.164±0.010),2组间差异无统计学意义(P>0.05)。术后6周,RANKL在对照组中表达呈弱阳性(0.162±0.004),而在实验组中表达呈强阳性(0.215±0.020),差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周,RANKL在对照组中表达呈阳性(0.176±0.022),在实验组中表达也呈阳性(0.197±0.008),差异无统计学意义(P>0.05)。3骨微环境中raskl和opg的表达坐骨神经切断术是一种制作废用性骨质疏松动物模型的有效方法,神经切断术后肢体瘫痪可以导致废用性骨代谢负向平衡。但在随后的实验中发现:神经切断术后,对侧肢体也出现了几乎相同状况的骨质疏松。制动并不是导致废用性骨质疏松的唯一途径,可能还有其他因素参与其中。现有研究表明:P物质是一种神经肽类激素,是广泛分布于全身的神经递质,主要分布于中枢和外周神经系统,呈现复杂的生理效应。在人体多种骨组织内分布有P物质样神经纤维,包括长骨、关节、牙齿等,以代谢活跃的部位如骨膜、干骺端及骺板附近分布最多,在骨干处的皮质和骨髓则相对较少。这些肽能神经主要与血管伴行,有少数游离神经末梢伸出并止于骨膜衬里细胞层、骨髓细胞团等,其作用的靶细胞为成骨细胞和破骨细胞等。王树森等切断大鼠单侧坐骨神经,并将断端近侧结扎,结果发现脊髓后角P物质含量在2～6周时下降至最低,随之回升,至16周恢复正常。RANK/RANKL是调节破骨细胞分化的主要信号途径,目前国外对此做了大量研究:RANK受体上游主要存在2个配体即RANKL和OPG,当RANKL和RANK结合后,就可激活其下游的信号途径促进破骨细胞形成,起到正向调节作用;而OPG可与RANKL竞争性结合RANK,从而抑制破骨细胞的分化和功能,起到负向调节作用。总之,RANKL/RANK/OPG信号轴在调节破骨细胞的分化和功能方面起到至关重要的作用。最近研究结果认为:一旦RANKL和RANK相结合,胞质中的肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNFreceptorassociatedfactor6,TRAF6)就和RANK膜内部分特定的结构域相结合,TRAF6下游的5条信号途径被激活,其中核因子(NF)-κB、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、P38和ERK4条途径主要涉及骨的重吸收功能,Src途径主要与调节破骨细胞的生存、骨架重排有关。RANK可能通过一条新的信号途径调节破骨细胞分化。如上所述,微环境中OPG/RANKL表达量的相对比值对骨质疏松过程有重要的影响。免疫组织化学研究显示,RANKL和OPG被共同表达在几乎所有的组织中。通过本实验显示,大鼠术后6周,对照组术侧OPG表达呈强阳性,实验组呈弱阳性,差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周,实验组呈阳性,对照组也呈阳性,2组间差异无统计学意义(P>0.05)。大鼠术后6周,RANKL在实验组表达呈强阳性,在对照组呈阳性表达,2组间差异有统计学意义(P<0.05)。术后12周,RANKL在实验组呈强阳性表达,对照组呈阳性表达,2组间差异无统计学意义(P>0.05)。实验结果表明:坐骨神经切断术后大鼠股骨内微环境中P物质与OPG呈正相关,与RANKL呈负相关。说明P物质含量的高低可以影响到破骨细胞分化。正是由于坐骨神经切断术后P物质含量降低,导致OPG浓度下降而RANKL浓度增高。如前所述,骨微环境中OPG/RANKL表达量的相对比值对骨质疏松过程有重要的影响。OPG可与RANK竞争性结合RANKL,从而阻断RANKL与