葡萄糖-精氨酸水热合成碳量子点及其与dnp和ms-12ssdna间的亲和行为

葡萄糖-精氨酸水热合成碳量子点及其与dnp和ms-12ssdna间的亲和行为

0实验用碳点及其应用碳量点是体积小于10nm的纳米球形材料，称为碳点（cds）。目前制备碳点的方法大致分为:(1)自上而下法,主要有电弧放电法、激光刻蚀法、电化学氧化法等;(2)自下而上法,主要有微波法、超声法和水热合成法等。与传统半导体量子点相比,碳量子点具有无毒或低毒特性,良好的生物相容性和环境安全性、水溶性以及廉价易得等优点,所以在生物标记、荧光探针生物检测等领域都具有重要的应用价值。在众多合成方法中,水热法是一种非常适于实验室合成碳量子点的方法,该方法制备的碳点表面带有大量亲水性基团(如-OH、-COOH等),另外掺氮型碳点还带有氨基基团,具有更好的荧光效应;碳点表面的亲水基团是碳点功能化的基础,研究亲水性基团与生物分子间的相互作用,对碳点在生物医学领域的应用具有基础探索的重要意义。本实验以葡萄糖为主要碳源,精氨酸为氮源,采用水热法合成碳点,并运用TEM、FT-IR、XPS、UV和F-7000荧光分光光度计表征碳点性能,然后运用激光微量热泳动技术(MST)研究碳点与4种dNTP和单双链DNA分子间的相互作用。这对碳点标记DNA,制备碳点-DNA复合的荧光分子探针等碳点应用具有重要意义。1实验1.1dna序列葡萄糖(分析纯,SIGMA)、精氨酸(分析纯,SIGMA)、100mmol/L四种三磷酸脱氧核苷酸分子(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)。MST-1/2ssDNA序列(上海生物工程有限公司合成)如表1所示。电热鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)、X射线电子能谱仪(Thermo,Esclab250Xi)、F-7000荧光分光光度计(日立,F-7000)、傅里叶红外光谱仪(FT-IR,Nicolet,6700)、紫外-可见分光光度计(日立,U-3900)、聚合酶链式反应仪(PCR,杭州晶格科学仪器有限公司)、透析袋若干(美国spectrumlabs)、透射电镜(日立,H-7650B)、激光微量热泳动仪(MST,德国nanotemper)。1.2聚氯四氟乙烯反应剂的合成称取葡萄糖2g+精氨酸1g置于烧杯中,加入25mL去离子水,充分搅拌溶解后倒入聚氯四氟乙烯不锈钢反应釜中。将其置于电热鼓风干燥箱中180℃反应3h。产物使用1000Da的透析袋透析24h,去除未反应的原料和中间小分子产物,然后冷冻干燥,得到的物质重新称重,重溶于超纯水中,并对其进行TEM、荧光光谱等测试。1.3碳点溶液的配制将碳点配制成浓度为0.3mg/mL的溶液,固定碳点的溶度。将4种dNTP从100mmol/L开始进行1∶1梯度稀释成16个梯度,每梯度取5μL样品与5μL碳点溶液充分混合,室温静置5min左右,转移至毛细管中。将毛细管置于MST仪器中,在LEDpower20%、Laserpower20%及蓝光激发条件下进行MST实验测试。1.4dsna与退火将上海生物工程有限公司合成的MST-1/2ssDNA配制成浓度为100μmol/L的溶液,取等体积的初始浓度的MST-1ssDNA与MST-2ssDNA混匀,在PCR仪中进行退火形成dsDNA,退火条件如下:94℃3min,90~15℃每隔5℃梯度降温,每个温度阶段2min。将两条ssDNA与退火形成的dsDNA从初始浓度开始1∶1梯度稀释成16个梯度,每梯度各取5μL样品与5μL浓度为0.3mg/mL的碳点充分混合,室温静置5min左右,转移至毛细管中。将毛细管置于MST仪器中,在LEDpower20%、Laserpower20%及蓝光激发条件下进行MST实验测试。2结果与讨论2.1碳点的红外光谱表征碳点的TEM图如图1(a)所示,从图中看到黑色碳点分散性很好,粒子尺寸分布均匀,合成的碳点粒子直径约为9nm,结构呈圆球型(图1(b))。图2是碳点的FT-IR光谱,其中3338cm-1处为O-H或者N-H的伸缩振动峰,2935cm-1为羧酸的O-H伸缩振动峰,1767cm-1和1705cm-1为C=O吸收峰,1456cm-1和1371cm-1为伯醇和叔醇的吸收峰,1144cm-1和1039cm-1为C-O或者C-N的伸缩振动峰,760cm-1为杂环吸收峰。由此可知碳点表面富含羟基、羧基、氨基等亲水基团及部分C-N杂环结构。图3为碳点的XPS能谱图,使用XPSPEAK软件对图3中的N1s峰与C1s峰分别进行分峰拟合得到N1s高分辨图谱(图4(a))和C1s高分辨图谱(图4(b))。N1s峰分为398.45eV、399.60eV、401.5eV三个峰值,分别对应五元杂环吡啶型氮化物、六元杂环吡咯型氮化物及N部分取代石墨结构中C位置形成的石墨状化合物等结构;C1s峰分为284.61eV、285.64eV、286.52eV和288.24eV四个峰,分别对应着C=C、C-N、C-O和C=O等化学键结构。据此推测合成的碳点的表面含有大量的含氧和含氮的基团,这些基团应该为羧基、羟基和氨基等,这与碳量子点红外光谱表征得到的碳量子点表面带有的基团一致。图5(a)为碳点在水溶液中的紫外-可见吸收光谱和在370nm激发下的荧光光谱。吸收光谱上紫外区存在很强的吸收,并在276nm处有1个明显的吸收峰值,葡萄糖和精氨酸水溶液各自的吸收波谱在276nm处均无吸收峰,即该吸收峰的存在是由碳点存在而造成的。同时在370nm激发下获得的荧光发射光谱上发现碳点在445.4nm处存在峰值,此时碳点发射明亮的蓝色荧光,荧光光谱半峰宽为85nm。碳点用不同的激发波长激发获得的荧光发射波谱见图5(b),发现碳点的最佳激发波长并不在碳点的吸收峰值276nm处,而是在370nm附近,并且碳点的荧光光谱峰位在270~330nm内随着激发波长的增加有蓝移趋势,而在330~450nm内随着激发波长的增加逐渐红移。图5(a)中内插的(c)图为碳点溶液在自然光下拍摄的照片,溶液呈黄色,(d)图为同样的样品在365nm紫外灯照射下拍摄的照片,溶液由自然光下的黄色转变为蓝色溶液,这与荧光光谱中得到的结果一致。2.2碳点与dntp的k拟合分析荧光标记分子的热泳动测定是通过监测毛细管内的荧光分布F实现的。毛细管中荧光分布与荧光分子浓度相对应。定量碳点(A)浓度不变,T(dNTP)以不同浓度滴定A可以获得一系列的热泳曲线(图6(a))。通过归一化荧光Fnorm=Fhot/Fcold来绘制Fnorm对T不同浓度的对数曲线,获得S形的结合曲线,从而通过MST仪器数据分析软件拟合可以得到解离常数Kd值等。Kd定义为Kd=[A]*[T]/[AT],其中[A]、[T]及[AT]分别为分子A、T和AT复合分子的浓度;Kd值越高说明二者间的亲和力越弱。碳点与dNTP的Kd拟合S型曲线如图6(b)所示,可知碳点与dATP、dTTP、dGTP、dCTP分子的结合解离常数(Kd)值分别为2.59mmol/L、2.62mmol/L、1.75mmol/L、23.8mmol/L。水热法制备的碳点表面富含的羧基、羟基、氨基等亲水性基团如图7(a)所示,这些亲水性基团含有电负性大的结构,在水溶液中易与其他结构形成氢键。dNTP是聚合酶链式反应中DNA扩增的原料,双链DNA形成是通过碱基互补配对完成的,碱基互补配对又是以氢键形式结合的,即4种dNTP分子(图7(b))也具有易形成氢键的性质,据此推测碳点表面基团与dNTP结构易形成微弱的氢键结合,其结合强弱除与dNTP本身分子结构有关,还和碳点表面各基团含量有关。碳点与MST-1ssDNA、MST-2ssDNA和dsDNA间MST测试后软件Kd拟合的S曲线如图8所示,依据MST仪器自带数据分析软件计算拟合出碳点与两条互补的单链MST-1、MST-2分子间结合解离常数分别为4.75μmol/L、17.7μmol/L;单链DNA是柔性结构与碳点表面基团形成氢键的位点,造成两条互补单链DNA与碳点的解离常数不同的原因是两条互补单链DNA上碱基序列排布不同,MST-1由碱基A、T、C组成而MST-2由碱基A、T、G构成;这与前面测定的4种dNTP与碳点亲和强弱相对应。而双链DNA与碳点的分子间亲和力很弱,造成此现象的原因是退火后形成的双链DNA结构稳定,没有多余氢键位点与碳点结合。由此可知碳点与dNTP、ssDNA间存在微弱的氢键结合,结合强弱与分子结构有关。3碳点与dntp、单双链dna分子间的相互作用本实验成功以葡萄糖与精氨酸为碳源,采用水热法合成了碳点,多种表征手段