热应激对奶山羊瘤胃内物质消化率、生产性能及瘤胃上皮细胞形态结构的影响

热应激对奶山羊瘤胃内物质消化率、生产性能及瘤胃上皮细胞形态结构的影响

0膜过发酵对乳质及瘤胃功能的影响【研究意义】近年来，由于世界气候的持续更新，不仅中国南方，而且中国北方的奶牛也受到热应激（hytstys）的影响，严重制约了牛奶生产的健康发展，给奶业相关公司和农户造成了巨大的经济损失。瘤胃既是奶牛最为重要的消化代谢性器官,也是营养物质重要的吸收性器官,某些营养素能否被高效吸收、利用主要取决于瘤胃上皮细胞屏障功能的完整性。而完整性的破坏不仅可对营养素吸收产生不利影响,另外也会使瘤胃内的病原微生物及其异常代谢产物侵入机体循环系统,直接影响奶牛机体健康,并最终降低原料乳质量和生产性能。【前人研究进展】内蒙古农牧业科学院动物营养所奶牛课题组前期就热应激对奶牛生产的影响作了大量的研究,发现热应激可显著提高直肠温度、体表温度以及呼吸频率;显著降低采食量和日粮内营养物质消化率,严重影响生产性能的正常发挥;显著降低瘤胃内发酵指标pH、NH3-N浓度和VFAs浓度;使菌群结构发生显著变化;并导致瘤胃功能出现异常。且在高温环境条件下,高产奶牛产奶量下降幅度大于中产奶牛,热应激对高产奶牛瘤胃功能的负面影响程度大于中产奶牛。【本研究切入点】热应激在降低奶牛生产性能和生理机能,导致瘤胃功能出现异常的情况下,是否对瘤胃上皮细胞形态结构及屏障通透性也产生了不同程度的影响?目前国内外还未见相关的研究报道。因此,研究热应激条件下奶牛生产性能和瘤胃功能,是合理制定营养措施,缓解奶牛热应激的基础。【拟解决的关键问题】本试验将以泌乳中后期奶山羊为动物模型,探讨热应激对奶山羊直肠温度、呼吸频率、日粮内各营养物质消化率、瘤胃液发酵参数、生产性能以及瘤胃上皮细胞形态结构的影响,旨在为动物在炎热环境中能够维持正常生理机能以及探索促进动物抗热应激的方法参考。1材料和方法试验于2012年6—9月在内蒙古农牧业科学院动物试验基地进行。1.1试验材料1.1.1饲养环境及日粮采用单因子试验设计,将8只体况良好、体重30—35kg、年龄2—3岁、胎次和产奶量相近均处于泌乳中后期且安装有瘤胃瘘管的奶山羊随机分为常温对照组和热应激组,每组4只羊。饲养环境采取人工控温控湿,热应激组试验奶山羊饲养于高温高湿环境(T=25—36℃,RH>60%),常温对照组奶山羊的饲养温湿度条件以奶山羊的温度适中区来设定(T<22℃,RH<45%)。实验动物单笼饲养,每日7:00和19:00两次等量饲喂,自由饮水。试验期为45d。基础日粮配制参照NRC(1981)饲养标准。用温湿指数(temperature-humidityindex,THI)计算当连续一周早中晚THI>72时,动物模型建立。1.1.2玉米、豆浆、麦麸、青干草参照奶山羊饲养标准和文献配制试验日粮。以玉米、豆粕、麦麸、青干草为主要原料。试验羊自由采食、自由饮水,日挤奶2次。试验日粮组成及营养水平见文献。1.2测试方法1.2.1试验设计1.2.2温度和相对湿度试验期间在试验羊舍内的中间和两端与羊体等高处(距地面约1.5m)挂温湿度表,记录每天7:00、14:00及22:00温度和相对湿度。根据Drackley等方法计算THI,THI=td-(0.55-0.55RH)(td-58)。式中,td为华氏温度,RH为相对湿度。当羊舍THI<72时表示无热应激;72≤THI≤79时为轻度热应激;79<THI≤88时为高度热应激;THI>88时为重度热应激。1.2.3奶山羊用兽用温度试验从试验开始分别在每周一、三、五的7:00、14:00、19:00分3次用兽用温度计逐头测量试验奶山羊直肠温度。每天07:00、14:00、22:00逐头测定呼吸频率3次,每次测15s,然后乘以4计算每分钟奶山羊呼吸频率,方法为观测肷部起伏数。1.2.4消化率试验和生产性能试验1.2.4.回潮过程分析粪样收集:将试验期间每隔7d收集的鲜粪样称重后按10%采样,混合后于65℃烘24h,置于实验室回潮24h后称重,测得初水分并制成分析样本。剩料处理:试验期间每隔7d早、晚7:00共两次准确称取各重复组羊的剩草和剩料量,将早晚两次剩草和剩料量相加计算日采食量。将每天收集的剩料混合后缩减,制备分析样本。1.2.4.纤维原料的检测(1)消化率测定消化代谢试验中采集的饲料和粪样中的DM(干物质)(GB/T6438-1992)、OM、CP(粗蛋白)(GB/T6438-1992)、NDF(中性洗涤纤维)(AOAC2002.04)、ADF(酸性洗涤纤维)(AOAC973.8)的测定参照相关标准进行测定。(2)生产性能测定试验期间每7d测定一次产奶量,同时按早、晚6﹕4的体积比采集50mL混合乳样(加入重铬酸钾30mg),采用全自动乳成分分析仪(BactoScanFCCombiFoss6000,FOSS公司生产)测定乳脂、乳蛋白、乳糖。1.2.5肿瘤胃的检测和测定1.2.5.ph和nh3-h的检测试验期间选择一天在早晨饲喂之后0、3、6、9、12、15、20和24h采集对照组和热应激组每只奶山羊的瘤胃液。方法:动物绑定,利用专用口腔采样器采集瘤胃液。每头奶山羊采集100mL的瘤胃液,弃掉初采集含有较多黏液的部分,装入经39℃预热且内充CO2的保温瓶,现场立即用pH计(酸度计)测定pH。之后用4层纱布过滤,将滤液4000r/min离心15min,取上清液,装入一个内充CO2的瓶中。用移液管移取0.5mL上清液置于预先装有4.5mL0.2mol·L-1盐酸的采样瓶中,摇匀,用于测定NH3-H浓度;再移取4mL上清液置于采样瓶中,然后加入1mL、25%偏磷酸,以测定总挥发性脂肪酸(VFA)、乙酸、丙酸、丁酸浓度。上述样品均于-20℃保存,待测。1.2.5.标准曲线及分析方法pH的测定:用pHS-3B型高精度酸度计直接测定;NH3-N浓度的测定:参照文献的方法进行;NH3-N浓度测定试剂的配置:(1)A液(水杨酸钠/亚硝基铁氰化钠):称取0.08g亚硝基铁氰化钠,溶解于100mL、14%的水杨酸钠溶液中,避光保存于4℃冰箱中。(2)B液(氢氧化钠/二氯异三聚氰酸):称取1.2g氢氧化钠溶解于100mL蒸馏水中,即为0.3mol·L-1NaOH溶液,再加0.5g二氯异三聚氰酸(DCI),于冰箱4℃保存。(3)氯化铵标准溶液:精确称取干燥氯化铵(A.R.)0.382g,用0.2mol·L-1盐酸溶液溶解,定容至100mL,此含氮量为1mg·mL-1的溶液作为保存液。试验时取保存液10mL,用蒸馏水稀释定容至100mL,为工作液,含氮量10mg·100mL-1。氨氮标准曲线的绘制:依次量取工作液0、1、2、4和6mL,置于5个带有编号的50mL容量瓶中,接着分别加入蒸馏水10、9、8、6和4mL,使工作液与水的终体积达到10mL,再用0.2mol·L-1盐酸定容,这就是每100mL中含氮量为0.0、0.2、0.4、0.8和1.2mg的标准系列溶液。准确量取以上各标准系列溶液0.4mL分别置于5个10mL试管内,各管中均加入A液2mL和B液2mL,摇匀,静置10min后,在700nm波长处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标,氨根离子浓度为横坐标绘制的标准曲线见图1。样品中氨氮含量测定:取0.4mL固定液加入干净的试管中,再在试管中加入2mLA液和2mLB液,混匀后静置10min,在700nm波长处测定吸光度值。VFA浓度的测定:参照文献内标法测定。测定方法:A.设定气相色谱仪(美国惠普5890-Ⅱ型气相色谱)的参数,氮气流速:55mL·min-1;氢气流速:14mL·min-1(压力为1.2kg·cm-3);空气流速:140mL·min-1(压力为0.35kg·cm-3);柱温140℃,进样室温度200℃,汽化室温度250℃;H2作载气,最佳实用线速:15—20cm·s-1;N2作载气,最佳实用线速:10—20cm·s-1。B.样品处理:取已固定好的样与甲酸按3﹕1配制的混合液1mL,混匀,静置半小时以上。取1mL混合液加入2g酸性吸附剂(无水硫酸钠:50%硫酸:硅藻土(W/V)=30﹕1﹕20)和4mL的31.25mmol·L-1的巴豆酸溶液(溶剂为CHCl3),摇匀,澄清后用1μL的微量进样器取样品上机进行测定乙酸、丙酸和丁酸的含量。1.2.6透射电镜观察分别于热应激30和45d时屠宰试验羊和对照组羊各2只,取瘤胃背囊和腹囊组织,用装有10%中性福尔马林液固定,用H.E染色法和透射电镜观察热应激对瘤胃上皮组织的损伤程度。1.2.7设计结构参数的确定数值变量先行正态性检验和方差齐性检验,符合正态分布的方差齐性数值数据用“均数±标准差”(mean±SD)表达,组间比较采用成组设计两样本t检验;非正态分布的数据用中位数(IQR)表示,采用Wilcoxon秩和检验。构成比分类数据的分析采用秩转换非参数检验,两指标间的相关性采用直线相关分析(Spearman相关分析),由SPSSforwindows-12.0统计软件(SPSSInc.,Chicago,IL,USA)完成。2结果2.1早中晚热应激试验试验期间羊舍早上平均、最低和最高温湿指数分别为73.97、67.45和77.03;中午平均、最低和最高温湿指数分别为81.71、76.19和87.92;晚上平均、最低和最高温湿指数分别为78.79、74.76和85.92。早上平均、最低和最高温度分别为25.8、22.4和28.6℃;中午平均、最低和最高温度分别为32.4、28.6和36.8℃;晚上平均、最低和最高温度分别为26.5、22.4和28.6℃。试验共持续45d,其中在整个试验期间只有第6天早上7:00试验羊处于无热应激状态,第14天为轻度热应激,第30天为高度热应激,整个试验期试验羊没有产生重度热应激。羊舍早中晚的THI详见图2。由图2可以看出,试验期间试验羊THI主要为72和87,处于轻度和高度热应激,由此可以判断奶山羊在整个试验期间处于持续热应激状态。2.2呼吸频率的变化由表1结果可以看出,热应激期间奶山羊直肠温度和呼吸频率都极显著地升高了,特别是呼吸频率由43次/min升高到131次/min,升高了将近3倍。该试验结果与王立志在奶山羊上和唐娇玉等在奶牛上的试验结果较为接近。2.3热反应对山羊各养分消耗率的影响由表2结果可以看出,与对照组相比,热应激期间奶山羊DM、CP、OM、NDF和ADF消化率都极显著地下降。2.4奶产量和产量由表3结果可以看出,与对照组相比,热应激极显著地降低了奶山羊干物质采食量和奶产量(P<0.01),该研究结果与王立志在奶山羊上和Snaehez等在奶牛上的试验结果较为接近。由表3结果还可以看出,热应激期间奶山羊乳中乳蛋白和乳脂含量显著低于对照组(P<0.05),乳糖含量变化不显著(P>0.05)。2.5热耦合对山羊胃发酵参数的影响2.5.1两组ph的变化从表4结果可以看出,对照组和热应激组奶山羊在采食后测定的pH的变化趋势是一致的,均为在第1次采食3h后下降为最低,分别为6.18和6.03(P<0.01),之后两组pH开始有所上升,均在采食后12h达到最高,分别为6.45和6.38(P<0.05);在第2次采食后对照组和热应激组又呈现出相同的变化趋势。但热应激组各时间点的pH均显著或极显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)。2.5.2热应激对两组nh3-n浓度的影响从表5试验结果可以看出,对照组和热应激组奶山羊在采食后测定的NH3-N浓度的变化趋势是一致的,均为在第1次采食后3h上升为最高,分别为20.19和19.02mg·100mL-1(P<0.05),之后两组NH3-N浓度开始下降,均在9h时达到最低,分别为13.46和12.59mg·100mL-1(P<0.05);在第2次采食后对照组和热应激组又呈现出相同的变化趋势。但热应激组各时间点的NH3-N浓度均显著低于对照组(P<0.05)。2.5.3tvfa的测定从表6试验结果可以看出,对照组和热应激组奶山羊在采食后测定的TVFA浓度的变化趋势是一致的,均为在采食后9h上升为最高,分别为43.46和41.21mmol·L-1(P<0.05),之后两组TVFA浓度开始下降,均在12h时达到最低,分别为29.49和25.80mmol·L-1(P<0.05);在第2次采食后对照组和热应激组则在采食后3h,即15h时达到最高,分别为53.51和51.32mmol·L-1(P<0.05),之后呈下降趋势。但热应激组各时间点的TVFA浓度均显著低于对照组(P<0.05)。从表7试验结果可以看出,对照组和热应激组奶山羊在采食后测定的乙酸、丙酸和丁酸浓度的变化趋势是一致的,均为在采食后6h上升为最高,分别为22.54、20.58mmol·L-1(P<0.05),13.58、11.59mmol·L-1(P<0.05),6.85、6.12mmol·L-1(P<0.05),之后呈下降趋势,均在12h时达到最低,分别为17.68、15.25mmol·L-1(P<0.05),7.65、6.25mmol·L-1(P<0.05),4.56、3.98mmol·L-1(P<0.05);在第2次采食后对照组和热应激组则在采食后3h,即15h时达到最高,分别为34.25、30.698mmol·L-1(P<0.05),15.34、13.98mmol·L-1(P<0.05),6.21、5.68mmol·L-1(P<0.05),之后则呈下降趋势。但热应激组各时间点的乙酸、丙酸和丁酸浓度均显著低于对照组(P<0.05)。2.6热应激对奶山羊瘤的黏膜特性的影响本试验随着热应激的进行,试验羊只表现为目光无神、精神沉郁、呈躺卧姿势、眼睑闭合呈昏睡状态,且反刍次数明显减少。从图3所示的试验羊只屠宰图片结果可以看出,与对照组相比,奶山羊在热应激30d时,发现奶山羊瘤胃液呈稀粥状,酸臭味较浓,且奶山羊瘤胃黏膜乳头呈现大范围的坏死、脱落;当在热应激45d时,黏膜乳头坏死、脱落情况更为严重。说明热应激可对动物瘤胃黏膜组织造成一定程度的损伤,进而影响其生产性能,且长时间的热应激会直接影响动物的健康状况。2.7热应激对瘤胃黏膜组织染色的影响从表8结果可以看出,与对照组相比,奶山羊在热应激30d时,瘤胃背囊绒毛长度和宽度分别比对照组缩短430.26和145.17μm(P<0.05),瘤胃腹囊绒毛长度和宽度分别比对照组缩短了1355.85和144.34μm(P<0.05);而在热应激45d时,瘤胃背囊和腹囊的绒毛长度和宽度分别比对照组缩短了543.53、221.78μm(P<0.01)和1461.42、323.78μm(P<0.01)。且随着热应激时间的延长,瘤胃背囊和腹囊的绒毛长度和宽度缩短的也越短,分别缩短了为113.27、76.61(P<0.05)和105.57、179.44μm(P<0.05)。从图3的瘤胃黏膜组织染色结果来看,热应激导致奶山羊瘤胃上皮乳头绒毛断裂,脱落。对应热应激组和对照组奶山羊瘤胃上皮组织H.E染色结果详见图4。2.8瘤胃上皮细胞微绒毛的变化通过电镜观察可以看出,对照组瘤胃上皮组织微绒毛排列整齐,细胞连接结构正常,细胞器正常。热应激30d组瘤胃上皮组织微绒毛出现排列不整,部分缺失,细胞连接不清,细胞紧密连接出现扩张。当热应激持续45d时,瘤胃上皮组织微绒毛发生脱落严重,内质网空泡变性,细胞紧密连接扩张,出现大量的自噬体、未见细胞核,细胞凋亡严重(图5)。3热应激试验结果奶牛热应激时,其采食量、产奶量以及许多生理生化指标等都会发生一系列的变化,但并不是所有指标都能直观的反映出奶牛是否处于热应激状态。一般情况下可通过观测奶牛的直肠温度和呼吸频率来判断奶牛是否处于热应激状态,此外奶牛采食量、产奶量等在一定程度上也可作为奶牛热应激的评判标准。但生产中最常利用的是外界环境参数来作为热应激的评判标准。THI是结合空气温度和湿度来综合评价环境的一个指标,是判断奶牛和其它动物是否处于热应激状态的常用环境指标。一般当THI>72时,奶牛已经发生热应激反应,当THI为72—78时,奶牛会产生轻微热应激;当THI为79—89时,奶牛会产生中度热应激:当THI>90时,奶牛会产生严重热应激反应。从本试验结果可知,在为期45d的试验期间除第6天7:00时试验羊处于无热应激状态,其余时间段试验羊THI主要为72和87,处于轻度和高度热应激,且极显著提高直肠温度和呼吸频率,由此可以判断奶山羊在整个试验期间处于持续热应激状态,说明在本试验中构建的动物热应激模型是成功的。瘤胃是奶牛营养物质消化吸收的主要场所,瘤胃组织中某些营养素能否被高效吸收、利用主要取决于瘤胃上皮细胞屏障功能的完整性。而完整性的破坏不仅可对营养素吸收产生不利影响,另外也会使瘤胃内的病原微生物及其异常代谢产物侵入机体循环系统,直接影响奶牛机体健康,并最终降低原料乳品质和生产性能。从本试验热应激影响生产性能的研究结果可知,热应激显著降低了日粮营养物质的消化吸收、瘤胃液