高频正弦波振动对制动大鼠比目鱼肌纤维肌球蛋白重链表达的影响

高频正弦波振动对制动大鼠比目鱼肌纤维肌球蛋白重链表达的影响

由于运动减少、刹车或肌肉负荷，骨骼明显减少，其重量、体积和肌纤维横截面积也发生了显著变化。这种变化对提高和恢复人体技能的能力以及肌肉的恢复效率以及运动生活有着深远的影响。因此废用所致肌肉萎缩已成为运动医学与康复医学中亟待解决的课题之一。目前对于废用性肌萎缩防护措施的研究已有一定的积累,但是在实际应用中,它们又各自存在着一定的缺点和局限性。所以,随着我国体育事业的发展,寻找和制定更为安全有效的防护措施具有重要意义。在废用状态下,肌梭的传入放电减少,并出现明显退行性改变,这可能是废用性肌萎缩发生的重要原因之一。因此我们推论,如某种方法可以使肌梭的传人增强,则在理论上能够对抗废用性肌萎缩。研究表明,高频正弦波振动(HFV)可以选择性地兴奋肌梭,50~800HzHFV可使肌梭产生明显的应激反应。为此,我们以大鼠后肢伸长位制动为废用动物模型,采用短时间歇式振动的方法,结合免疫组化染色法检测,观察HFV对制动大鼠比目鱼肌(SOL)MHC表达的影响,探讨其对废用性肌萎缩的对抗作用,为寻找预防和治疗废用性肌萎缩的有效措施提供资料。1方法1.1g之间的相关性实验全部采用健康雌性SD大鼠(西安交大医学院实验动物中心提供),体质量在230~240g之间。按体重配对原则将30只动物分为3组:制动(IMM)14d组,制动+高频振动(IMM+HFV)14d组及正常同步对照组(CON,无制动处理),每组10只。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。1.2固定的踝关节背伸和膝关节动物麻醉后,在其左侧后肢的踝关节、膝关节及腹股沟等血管容易受压处衬一层薄厚适宜的棉垫,然后用石膏绷带由踝关节向上缠绕至大腿与腹股沟处,将动物后肢固定在踝关节背伸(约45°)而膝关节伸展(约180°)位,使SOL处于伸长位(14d)。1.3振动测定和方法在制动14d内,对IMM+HFV大鼠,每天在其SOL肌腹部位采取短时多次的间歇式振动方法进行振动(100Hz,300μm),振动仪由课题组自己研制(专利申请中)。具体振动过程如下:每振动1min后间歇1min,重复4次后间歇2min,此为一个振动回合,一个振动点每回合振动时间总计4min(不包括间歇时间),每次重复振动3个回合。每天进行4次振动,每天每只大鼠共计振动时间为48min。1.4灌流、保鲜、石蜡包埋实验动物用乌拉坦(1.5g·kg-1,腹腔注射)麻醉后,称体质量后经升主动脉灌流固定。即先注入温生理盐水至右心耳流出液变为淡红后,迅速改用40g·L-1多聚甲醛进行灌流。前1/2固定液快速注入,后1/2固定液缓慢滴注,维持45~60min。灌流后,立即取出左侧SOL,称重并修整组织块(以100g体质量标化计算比目鱼肌湿重体重比,MWW/BW),并置入40g·L-1多聚甲醛固定液中,经4℃过夜后,进行垂直方向的常规石蜡包埋。切片时调整蜡块的方向,以获得与肌肉长轴垂直的横截面的组织切片,切片厚度5μm。本实验选用一种抗快缩型MHC抗体(MY-32),用ABC法进行免疫组化染色。1.5观察方法与数据处理采用Image-ProPLUS图象分析系统(MEDIACYBERNETICS)对各型肌纤维的细胞数进行定量分析,即对每一SOL组织各随机抽取1张接近肌腹中部的切片,每张切片在400倍光镜下随机观察5个视野,测定每个视野内各型肌纤维数,并计算各型肌纤维的构成比和肌纤维的横截面积(CSA),求出每组动物的均值。实验数据采用SPSS10.0软件中的单因素方差分析法(ANOVA)进行统计分析。实验结果以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,取P<0.05作为显著性差异的界值。2结果2.1各时间点肌纤维的构成比及加速试验结果研究所采用的MY-32(抗快缩型MHC抗体)能够分辨出所有快缩型(fast-twitch)肌纤维MHC的表达。免疫组化染色显示,在CON组大鼠SOL切片中,镜下可见少数肌纤维中MHC表达呈阳性(深棕色),而在多数肌纤维中MHC表达则呈现阴性(无着色沉淀),表明大鼠SOL是以慢肌为主的肌肉组织。CON组大鼠SOL梭外肌纤维结构特征:肌束排列整齐有序,肌纤维基板和肌间膜平滑。大鼠行制动实验14d后,在IMM组可见梭外肌快缩型MHC的表达与CON组相比有所增强,大鼠SOL肌纤维的构成比有明显改变,Ⅰ型肌纤维(慢肌)的构成比减少,由85%减少到71%(由光镜计数定量分析),Ⅱ型肌纤维(快肌)的构成比增加,由15%增加到29%,IMM组I、II型肌纤维的平均横截面积以及比目鱼肌湿重体质量比均有所下降,与CON组对比有显著性差异(P<0.05)。这表明制动使SOL有了慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。IMM组大鼠SOL梭外肌纤维结构特征:肌束状结构紊乱,肌纤维间隙加大,肌膜粗糙而不平滑,肌内膜下结缔组织大量增生,偶尔可见肌纤维碎片,有呈病灶性表现的倾向。而大鼠制动期间给予HFV后,在IMM+HFV组可见Ⅰ型肌纤维构成比与CON组相比表现出轻微的下降,Ⅱ型肌纤维的构成比表现出轻微的上升,但其变化差异在统计学上无显著性意义(P>0.05)。IMM+HFV组与IMM组的染色结果相比,Ⅰ型肌纤维的构成比明显上升,由71%增加到80%,同时Ⅱ型肌纤维的构成比明显下降,由29%减少到到20%,且这种变化具有显著性差异(P<0.05)。IMM+HFV组I、II型肌纤维的平均横截面积以及比目鱼肌湿重体质量比与CON组对比均有所下降,但无显著性差异(P>0.05)。结果提示,在制动期间对大鼠施加HFV可以对抗因制动而引起的梭外慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。IMM+HFV组大鼠SOL梭外肌纤维结构特征:废用引起的显微结构改变明显减轻,肌束排列较为整齐,结构紧凑,肌束间界限比较清晰。2.2imm对大鼠sol肌梭结构的影响肌梭位于肌腹的深层,根据梭内肌纤维的形态、功能、染色特性可将其分为核袋和核链纤维。核袋纤维较长,核链纤维较细小,核袋纤维根据其组织化学、超微结构和机械特性的不同,又可区分为核袋Ⅰ纤维(动力性核袋纤维)和核袋Ⅱ纤维(静力性核袋纤维)。正常成年大鼠SOL中的肌梭由4~5条梭内肌纤维组成:1条核袋Ⅰ纤维,1条核袋Ⅱ纤维和2~3条核链纤维,其外则由结缔组织构成的梭囊包绕。CON组大鼠SOL肌梭的免疫组化染色结果显示,MHC的表达核袋Ⅰ纤维呈阴性(-),核袋Ⅱ纤维呈阴性(-)或弱阳性(-/+),核链纤维呈强阳性(++)。CON组大鼠SOL肌梭结构特征:被囊膜完整,梭内肌的肌原纤维边界清晰,轴周间隙结构正常,核袋和核链纤维区分明显。废用14d后,IMM组大鼠SOL肌梭的核袋Ⅰ纤维中MHC的表达仍呈阴性(-),核袋Ⅱ纤维呈阳性(+),核链纤维表达增强,这表明制动使梭内肌呈现了慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。IMM组大鼠SOL肌梭结构特征:梭内肌破坏严重,部分肌膜溶解消失,轴周间隙增宽,层次结构不清,内囊壁部分肿胀溶解。然而在IMM+HFV组大鼠梭内肌纤维中MHC的表达及显微结构的改变均不明显,接近于正常大鼠(见图1)。结果提示,在制动期间对大鼠施加HFV,可以对抗因制动而引起的梭内慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。3hfv在肌梭及抗菌材料转化中的作用MHC是骨骼肌纤维中最重要的肌原纤维蛋白之一,含有与肌肉收缩速度有关的活性酶,维持肌细胞结构的完整性。MHC的表型决定着肌纤维收缩特性的不同,其变化必然会影响肌纤维的代谢和功能特性。本实验选用的抗快缩型MHC抗体(MY-32),是以兔的快肌纤维作为免疫源而得到的抗体,仅检测快肌MHC的一个表位,可以同快肌纤维的所有亚型发生免疫反应,同慢肌则不发生反应,因此可同时检测梭内、外肌纤维中所有快缩型(fast-twitch)MHC的表达。骨骼肌纤维根据其形态学特征、代谢酶活性以及所含肌球蛋白重链表达的不同,可分为Ⅰ型和Ⅱ型两大类。SOL是一种慢肌,也是典型的抗重力肌,其中Ⅰ型肌纤维占85%以上,因此常作为肌肉萎缩的研究对象。以往的研究表明,在废用状态下,骨骼肌发生明显的萎缩,其质量、体积及肌纤维的横截面积均发生明显改变,骨骼肌中慢氧化型纤维数量明显减少,而中间型、快氧化型和酵解型纤维数量却增加。我们的实验结果与前期的文献报道一致:废用14d后,大鼠SOL梭外肌纤维MHC的表达水平和表型发生了改变,Ⅰ型肌纤维的构成比明显减少,Ⅱ型肌纤维的构成比明显增加,出现了Ⅰ型肌纤维向Ⅱ型肌纤维转化的趋势。肌梭与骨骼肌在发生学上有着相同的起源与血供来源,与梭外肌为同一反射弧的不同部分。核袋Ⅰ纤维的代谢特点类似慢肌,而核袋Ⅱ纤维和核链纤维则类似快肌。Fischbach和Robbins等人曾经在肌肉制动模型上研究肌梭的传入活动,发现肌肉制动不但可引起肌肉本体感受器的传入冲动减少,而且肌梭的核袋和核链纤维的横截面积也减少。我们的研究表明,在制动状态下,由于肌梭受到的适宜刺激减少,向中枢传入的神经冲动随之减少,进而诱发脊髓前角运动神经元的兴奋性降低,运动单位的特性发生改变,进而影响兴奋收缩偶联中的动作电位的扩布,神经轴突、肌纤维及神经纤维的传导速度也发生改变,最终影响梭外肌的机械收缩功能,致使梭外肌的代谢、结构和功能改变,导致或加重梭外肌的萎缩。本研究免疫组化染色结果显示:废用14d后,大鼠SOL肌梭的核袋Ⅰ纤维中MHC的表达仍呈阴性,核袋Ⅱ纤维出现由阴性向阳性的转化,核链纤维MHC的表达有所增强,这表明制动使梭内肌呈现了慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。资料表明,HFV可以选择性地兴奋肌梭,使肌梭的传入放电活动增强,因此HFV常作为一种研究肌梭敏感性的方法,但其对废用性肌萎缩的对抗作用却鲜见报道。Falempin发现,对大鼠跟腱施以120Hz的HFV,可以明显地对抗大鼠失重性肌萎缩的症状,他推测:120Hz的HFV兴奋了肌梭的Ia类传入纤维(初级传入末梢),使之传入放电增强,增加了梭外肌的紧张程度,改变了梭外肌的功能特征和代谢环境,所以对大鼠肌萎缩产生了有效影响。另有研究证实,振动动物的肌肉可以使其初级传入末梢的兴奋性增强,而且还能够增强某些次级传入末梢的兴奋性,而振动肌腱则仅限于对初级传入末梢兴奋性的增强。因此,考虑到能够更大程度地兴奋肌梭,我们所采用的振动部位与Falempin有所不同,即由肌腱转为了肌腹。前期研究发现,这种肌肉振动方法对制动引起的废用性肌萎缩的具有一定的对抗作用,可使肌梭的传入冲动增加,可以减缓制动大鼠SOL肌纤维横截面积和湿重体重比的减少趋势。本次MHC染色结果显示,在大鼠制动期间给予HFV后,SOL梭外肌Ⅰ型肌纤维的构成比明显上升,同时Ⅱ型肌纤维的构成比明显下降,且这种变化具有显著性差异(P<0.05),SOL梭内肌纤维中MHC表达及显微结构的改变均不明显,接近于正常大鼠。结果提示,在制动期间对大鼠施加HFV可以有效地对抗因制动而引起的梭内、外慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势,这与Falempin和我们前期的研究结果是一致的。综上所述,我们认为,HFV对于废用性肌萎缩具有对抗作用,根本原因是由于HFV对肌梭兴奋性的诱发作用。推测其机制为:HFV诱使肌梭的初级传入末梢和某些次级传入末梢的兴奋性增强,使肌梭传向中枢的传入冲动增多,通过γ和α神经活动,增加了肌肉运动单位的募集,增大了骨骼肌的活动量与紧张度,改善了梭外肌的代谢环境,从而维持了肌肉的结构与功能状态,因此对肌肉因废用而造成的萎缩具有对抗作用。本研究为HFV作为一种对抗废用性肌萎缩的有效措施提供了有力的实验依据。4hfv对大鼠sol肌梭纤维表达的影响(1)大鼠行制动实验14d后,梭外肌纤维的平均横截面积以及比目鱼肌湿重体质量比均有所下降,梭外肌快缩型MHC的表达有所增强,Ⅰ型肌纤维的构成比减少,同时Ⅱ型肌纤维的构成比增加。这表明制动使SOL出现萎缩现象,呈现慢肌纤维向快肌纤维的转化趋势。(2)大鼠制动期间给予HFV后,梭外肌纤维的平均横截面积以及比目鱼肌湿重体质量比与IMM组对比均有所升高,Ⅰ型