紫外光谱测氨基酸类物质实验报告

氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定实验报告一、实验目的（1）掌握紫外–可见分光光度计的工作原理与基本操作。（2）学习紫外–可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。（3）了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。二、实验原理紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度（A）,然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c及厚度b成正比。其数学表达式为：（一）式（一）为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中T为透光率(透射比）。物质的吸收光谱反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的物质，由于分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来，因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息。氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（<220nm）均有光吸收，在紫外区（近紫外区）（220nm—300nm）只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统。苯丙氨酸最大吸收波长在259nm、酪氨酸在278nm、色氨酸在279nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280nm波长处，因此能利用分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。本实验将对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸进行光谱测定及相关定量测定。三、仪器和试剂1仪器紫外-可见-近红外分光光度计（UV-3600或UV-2401）；分析天平；0.5mL、1.0mL、2.0mL移液管若干；10mL带塞比色管若干。2试剂标准溶液(a):2.0g/L的苯丙氨酸溶液；标准溶液(b)：0.4g/L的酪氨酸溶液；标准溶液(c)：0.4g/L的酪氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）；酪氨酸待测样。四、实验步骤（1）分别移取标准溶液(a)（2.0g/L，1.0mL）、标准溶液(b)（0.4g/L，1mL）和标准溶液(c)（0.4g/L，0.4mL）标准溶液于10mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用。（2）分别移取0.00、0.5、1.0、1.5、2.0mL标准溶液（b）于5个10mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。（3）双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用。（4）在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤（1）中各溶液在200～350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax。（5）在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度。（6）在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。数据处理与分析1、将苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光谱叠加在一个坐标系中如下:由图中可以看出，苯丙氨酸的最大吸收波长为257.73nm；色氨酸为278.70nm；酪氨酸为275.15nm。对酪氨酸和色氨酸的光谱图作1-4阶导数分别如下：一阶导数二阶导数三阶导数四阶导数通过观察可知四阶导数光谱在230.49nm处色氨酸与酪氨酸分离最完全,故选取四阶导数处理标准液和未知样品。3.将标准液的光谱图分别做四阶导数曲线如下：4.将未知样的光谱图做四阶导数曲线如下：由图知未知样在230.49nm处的吸光度为-0.048.将以上述步骤测得的各标准酪氨酸溶液的吸光度为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制工作曲线如下：所得直线拟合方程为：Y=5×10-4-0.0026X.6.将未知样的吸光度（-0.048）代入得到的标准工作曲线方程，解得未知样中色氨酸的浓度为:18.654mg/L.六、思考题（1）本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的，是否可以在波长较短的吸收峰下进行定量测定，为什么？答：最大吸收处信号强度较大，误差较小，如果在较小的吸收峰下进行测定，峰值易受其它因素影响，而且读数误差较大，不是很合适。（2）被测物浓度过大或过小对测量有何影响？应如何调整？调整的依据是什么？答：浓度过大导致信号过大，在实际的测量中可能超出实验范围；而浓度过小可能会导致吸收峰不明显，给实验和计算带来较大误差。在实际实验中，应挑选在线性范围内的浓度相对平均合适的几个点进行测量，保证实验的准确性。（3）思考紫外-可见分光光度法应用于蛋白质测量的依据，并设计相应的实验方案，测定奶粉中蛋白质的含量。答：蛋白质分子中所含酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸的芳香环结构对紫外光有吸收作用。色氨酸的吸收最强，但由于一般蛋白质中酪氨酸的含量比色氨酸高许多，因此这一吸收可认为主要是由酪氨酸提供的。其最大值在280nm附近，不同的蛋白质吸收波长略有差别。在无其他干扰物质