微生物的基本培养技术【知识专讲精研】 高二下学期生物人教版选择性必修3

学习目标核心素养1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。2．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。3．概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室进行微生物分离和纯化的常用方法。1.科学思维：根据微生物的代谢类型分析培养基的组成。2．科学探究：讨论并掌握无菌技术的实验操作方法；讨论并掌握微生物的纯培养的方法。第2节微生物的培养技术及应用一微生物的基本培养技术从社会中来

向经过杀菌处理的牛奶中添加某些对人体有益的细菌，再经过发酵就可以制成酸奶，由于制作工艺并不复杂，一些人会在家里自制酸奶，自制酸奶虽然方便，但是食用自制酸奶导致肠胃不适的事件屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。那么，怎样才能保证无处不在的杂菌不混入发酵物中呢？

应该先对制作用具和原料进行灭菌处理，再接种纯的菌种，并控制发酵条件，避免杂菌进入。酸奶这需要应用无菌技术和微生物的培养技术19世纪中期，法国酿酒业曾一度遭到毁灭性打击，生产的葡萄酒出现了变酸变味的怪事…法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了微生物。一、微生物概述1.微生物的概念：_________________________的统称。难以用肉眼观察的微小生物原核生物(细菌、蓝细菌等)原生生物(如草履虫、衣藻等)真菌(如酵母菌、霉菌等)病毒新冠病毒细菌草履虫酵母菌2.研究和应用微生物的前提（也是发酵工程的重要基础）是：_______________________、_______________________。防止杂菌污染获得纯净的微生物培养物3.实验室培养微生物的条件：①要为人们需要的微生物提供合适的___________条件；②要确保__________________，并将需要的微生物分离出来。营养和环境其他微生物无法混入

人们按照__________________________，配制出供其生长繁殖的营养基质，即培养基。二、培养基的配制1.概念：微生物对营养物质的不同需求2.作用：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。3.类型：固体培养基液体培养基有

无

琼脂分离、计数、鉴定等扩大培养、工业生产长有酵母菌菌落盛有液体培养基划分标准培养基种类特点用途物理性质化学成分用途不加凝固剂加凝固剂，如琼脂工业生产观察微生物的运动、分类鉴定微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种含化学成分不明确的天然物质工业生产培养基成分明确分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定微生物在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物鉴别不同种类微生物选择培养基液体培养基半固体培养基固体培养基天然培养基合成培养基鉴别培养基延伸：培养基的类型及用途培养基中加氨苄青霉素具有抗氨苄青霉素能力的菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌选择培养基培养基+氨苄青霉素培养基

没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?采用__________培养基培养，大肠杆菌的菌落呈现____色。伊红美蓝黑以_____为惟一_____的培养基对土壤中的分解尿素的细菌进行筛选。氮源尿素当需要酵母菌和霉菌时，可以在培养基中加入青霉素，以抑制细菌和放线菌的生长，从而分离出酵母菌和霉菌；在培养基中加入高浓度的食盐溶液可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，可以将金黄色葡萄球菌分离出来。通常在培养基中加入______指示剂，培养分离出的细菌，若指示剂变____，可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。因为分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，使培养基的pH______。酚红红升高鉴别培养基选择培养基鉴别培养基选择培养基4、培养基的营养构成:（1）基本成分：碳源、氮源、水、无机盐。①碳源：无机碳源：CO2、CO32-、HCO3-有机碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等（自养微生物的碳源）（异养微生物的碳源）②氮源：无机氮源：NH4＋、NO3-、NH3等有机氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有机物是异养型微生物的碳源、氮源、能源。③无机盐：Ca、K、Mg为大量元素Zn、Cu、Mn、Co、Mo等微量元素凡是能够为微生物提供C、N等元素的营养物质。特殊营养物质：维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等（天然物质牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（2）还需满足微生物对

的需求pH、特殊营养物质、氧气④培养厌氧微生物时，需要提供_____的条件。①培养乳酸杆菌时，需要在培养基中添加_______；②培养霉菌时，需要将培养基调至_____；③培养细菌时，需要将培养基调至_____________；维生素酸性中性或弱碱性无氧表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培养基的营养组成组分含量提供的主要营养牛肉膏5g碳源、磷酸盐和维生素等蛋白胨10g氮源和维生素等NaCl5g无机盐H2O定容至1000ml水例：某种细菌培养基的营养构成5.培养基的配制原则(1)目的要明确：不同微生物需求不同，根据微生物的种类、培养目的进行配制。(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。(3)pH要适宜：不同微生物适宜生长的pH范围不同，可在培养基中添加缓冲剂维持pH稳定。【基础过关】(1)所有的培养基中都要加入琼脂。()(2)是碳源的物质不可能同时是氮源。(

)(3)培养霉菌时一般需将培养基调至碱性。(

)(4)培养厌氧型微生物时，除需要提供无机碳源之外，还需要提供无氧的条件。(

)××××(5)凡碳源都提供能量。（）(6)除水以外的无机物只提供无机盐。（）(7)无机氮源也可能提供能量。（）(8)培养基只能用于培养微生物。（）××√×

提示：培养厌氧微生物时，需要提供无氧的条件，其碳源的类型要看其同化作用类型，若为自养型则需要提供无机碳源，若为异养型则需要提供有机碳源。【典例】下表是牛肉膏蛋白胨培养基的配方，分析回答：注：牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质.材料牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水用量5g10g5g20g定容至1000mL(1)根据培养基的物理性质，该培养基属于________培养基，理由是_____________________________________________________________。(2)该培养基中主要提供碳源和氮源的物质分别是什么？属于有机物还是无机物？________________________________________________________。(3)该培养基培养的微生物同化作用类型是_____________，理由是_________________________________________________________。固体该培养基的配方中含有凝固剂琼脂牛肉膏主要提供碳源，蛋白胨主要提供氮源。二者均属于有机物异养型微生物该微生物的碳源和氮源是有机物(4)试从碳源和氮源的角度分析不同类型微生物所需的培养基成分的特点：

自养型生物异养型生物碳源CO2、Na2CO3等无机物__________________________氮源______________________________________________糖类等有机物NH3、硝酸盐等无机物尿素、蛋白质等有机物(1)培养自养型微生物，通常需要提供无机碳源，如CO2、NaHCO3等；而培养异养型微生物，则需要提供有机碳源，如糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等。(2)如果培养基里没有有机碳源，则通常培养的是自养型微生物；若含有有机碳源，则通常的为异养型微生物。(3)微生物最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常用的无机氮源是铵盐和硝酸盐。(4)对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源和能源。牛肉膏和蛋白胨来源于动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。(5)某些微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成生长因子所需要的酶或合成能力有限。小结：(6)培养基的配方中没有琼脂，则通常为液体培养基；培养基的配方中含有琼脂，则通常为固体或半固体培养基。扩大培养获得大量菌种时常用液体培养基。琼脂在培养基中仅作为凝固剂，不能为微生物提供能量和营养。(7)病毒为非细胞结构生物，只能在活细胞中营寄生生活。目前不能利用人工培养基来培养病毒，只有接种在活细胞或组织中，病毒才能增殖。三、无菌技术1.概念：_____________的培养微生物的操作技术。2.防止杂菌污染手段：主要包括____和____。（1）对实验操作的____、操作者的________，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的____、________和______等进行灭菌。防止杂菌污染消毒灭菌空间衣着和手器皿接种用具培养基思考：无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？还能有效避免操作者被微生物感染。超净工作台3.消毒（1）概念：

指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。（2）常用的消毒方法①煮沸消毒法：

100℃煮沸5～6min，可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。②巴氏消毒法：62～65℃下消毒30min或80～90℃处理30s～1min适合一些不耐高温的液体，如牛奶。可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且不破坏牛奶的营养成分。用70%酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。③化学药剂消毒法:④紫外线消毒法：

接种室、接种箱或超净工作台在使用前可用紫外线照射30min。可杀死物体表面和空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。4、灭菌（1）概念：指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子。①芽孢有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。

芽孢壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。②孢子细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞(繁殖体)。能直接发育成新个体。

（2）灭菌的方法：

①灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧效果：最彻底原理：使微生物燃烧对象：接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。

原理：使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等

对象：适用于耐高温，需保持干燥的物品。

玻璃器皿(如试管、培养皿、吸管、注射器)

金属器具(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌②干热灭菌：干热灭菌箱内160-170℃下加热2-3h干热灭菌箱原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性优点：操作简便，效果可靠，可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体。基本保持培养基的营养成分不被破坏。对象：培养基等。注：使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。③湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅内100kPa、121℃下维持15-30min.高压蒸汽灭菌锅类型适用范围操作方法消毒灭菌较为温和理化方法，杀死部分微生物（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法日常生活用品100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高温的液体62～65℃煮30min或80-90℃煮30s-1min化学药剂生物活体、水源等擦拭等,如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源紫外线紫外线照射30min灼烧灭菌接种的金属工具、接种时用的试管口或瓶口等直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧干热灭菌耐高温、需要保持干燥的物品,如玻璃器皿和金属用具等物品放入干热灭菌箱,160～170℃加热2～3h湿热灭菌培养基、培养皿等,生产和实验室常用高压蒸汽灭菌锅内,100kPa,温度121℃,15～30min接种室、接种箱，超净工作台小结：消毒与灭菌

某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下；然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下；将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。

【应用探究】（1）这个材料中哪些材料用具需要灭菌处理？（2）从实验结果来看，洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上的微生物的污染？培养皿、培养基

不能用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒；实验操作应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行(1)获得纯净的微生物培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。()(2)灭菌相比消毒对微生物的杀灭更彻底。(

)(3)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。()提示：培养基通常采用高压蒸汽灭菌，而接种环则采用灼烧灭菌。(4)培养基最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。(

)（5）接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌。（）（6）在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，防止被微生物感染。（）（7）使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。（）√√×√【基础过关】×√√【典例】微生物培养过程中，要重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染，请分析下列操作，正确的是(

)A.煮沸消毒法中100℃煮沸5～6min可以杀死全部微生物的细胞和芽孢、孢子B.将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌C.加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌D.家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌B培养基的类型培养基的营养物质消毒灭菌微生物的实验室培养【课堂小结】培养基无菌技术按物理性质划分按组成成分划分按功能划分基本成分：碳源、氮源、水、无机盐特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等煮沸消毒巴氏消毒紫外线消毒化学药剂消毒湿热灭菌干热灭菌灼烧灭菌检测1.下列有关以CO2为唯一碳源的自养微生物所需营养物质的描述中，错误的是(

) A.铵盐和硝酸盐等无机氮为该微生物提供必要的氮素 B.碳源物质不是该微生物的能源物质 C.水、无机盐也是该微生物不可缺少的营养物质 D.琼脂是该微生物的营养要素之一

解析铵盐和硝酸盐等无机氮为该微生物提供必要的氮素，A正确；以CO2为唯一碳源的自养微生物，二氧化碳不是该微生物的能源物质，B正确；水、无机盐也是该微生物不可缺少的营养物质，C正确；琼脂是凝固剂，不是该微生物的营养要素之一，D错误。D编号成分含量①粉状硫10g②（NH4）2SO40.4g③K2HPO44.0g④MgSO49.25g⑤FeSO40.5g⑥CaCl20.5g⑦H2O100ml（1）如表培养基可培养的微生物类型是

。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

.自养型微生物

含碳有机物

检测2.如表是某微生物培养基成分，请据此回答：固氮微生物

（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养

。传统发酵通常直接利用原材料中天然酵母菌工业生产通常使用人工选育的高活性酿酒酵母如何获得纯种酵母菌？四、微生物的纯培养1.培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体成为培养物；2.纯培养物、纯培养：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。（一）相关概念：微生物群分散或稀释单个细胞单个菌落繁殖3.菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。（注：菌落属于种群；不同菌落的大小、形状、隆起程度、颜色等不同）（二）纯培养的步骤包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养——酵母菌的纯培养（1）配制培养基称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml（定容）。1.制备培养基（2）灭菌将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100kPa、温度为121℃的条件下，灭菌15-30min。将5-8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160-170℃灭菌2h。培养基：用高压蒸汽灭菌锅湿热灭菌培养皿：在干热灭菌箱内干热灭菌（3）倒平板待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。①拔出锥形瓶的棉塞②将瓶口迅速通过火焰③用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基（10～20mL）倒入培养皿，立即盖上皿盖倒平板的具体操作步骤：④等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒转过来放置目的：既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。思考讨论：1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手即可。2.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？最好不要用这个平板培养微生物。防止空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。4.怎么确定所倒平板未被杂菌污染？3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。2.接种和分离酵母菌通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养可以分离得到单菌落。(1)原理：单个细胞微生物群单个菌落连续划线分散或稀释生长繁殖(2)方法：“平板划线法”①灼烧接种环，直至接种环金属丝烧红②在火焰旁冷却接种环，拔出酵母菌培养液试管的棉塞③试管口通过火焰④在火焰附近用接种环蘸取一环菌液⑤试管口通过火焰，并塞上棉塞⑥将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线“平板划线法”实验操作第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌12345①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次

②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灭菌，划线结束后也要灭菌④划线后,培养皿倒置培养（3）平板划线法注意事项

分区划线法（最常用）（4）平板划线法中，三种灼烧接种环操作的目的连续划线法（1）为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上原有微生物灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后思考讨论：⑵在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？⑶在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2023/10/203.培养酵母菌完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24～48h。思考1：为什么要将平板倒置？思考2：为什么要同时放入未接种的平板？既可以防止培养基表面的水分挥发；又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染作对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染（2）在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点，则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。（3）你是如何记录实验结果的？可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等。4.结果分析与评价（1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？在未接种的培养基表面应该没有菌落生长，如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。评估论点的可信程度

所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。(1)倒平板操作中，等待平板冷却凝固后，要将平板倒置。()(2)平板划线操作中，划完一个区域后要将接种环灼烧，再划下一个区域。(

)(3)平板划线法接种时，每一次划线前都要蘸取菌种。()解析：平板划线法接种时，仅在第一次划线前蘸取菌种，不能每一次划线前都蘸取菌种。(4)需要将一个不接种的培养基放在相同的条件下培养，以检验培养基的灭菌是否合格。()（5）倒平板时将培养皿的皿盖拿开，以便于将锥形瓶中