PCR技术的原理及应用 完整版

1PCR技术的原理及应用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，杜邦公司Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）。基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖。KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃PCR的改进与完善Mullis最初使用DNA聚合酶I的Klenow片段不耐高温37°C下反应PCR技术的改进与完善1988年Saiki等从温泉中分离的一株嗜热杆菌（thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶TaqDNA聚合酶耐热性忠实性扩增长度平台期Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的扩增效率：循环数. 扩增子数(靶序列拷贝数)1 22 43 84 165 326 6420 1,048,576301,073,741,824(10亿)

实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用提纲

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR定义常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时荧光定量PCR原理实时定量PCR技术：

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理--------扩增曲线扩增曲线图：

横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：

前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99

真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：

PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；

Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反应：

X=X0*2n非理想的PCR反应：

X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数

X：第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0

(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lgM=lgX0

(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:

lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理---------标准曲线

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。

Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量25提纲

实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用

实时荧光定量PCR原理

实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用非特异性荧光标记：

1、SYBRGreenⅠ特异性荧光标记：

2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor实时荧光定量PCR原理---DNA产物的荧光标记QQR实时荧光定量PCR方法1

－－－SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreenⅠ只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreenⅠ发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBRGreen实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreenⅠ法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物CyclenumberFlourescenc104102SampleCyclenumberLgofDNAconcentrationSYBRGreenⅠ法定量原理

模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。

Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。SYBRGreenⅠ法--------PCR反应的建立反应体系的建立及优化:SYBRGreenⅠ使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同SYBRGreenⅠ法应用范围

起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBRGreenⅠ法优缺点

对DNA模板没有选择性

----适用于任何DNA

使用方便

-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点

容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点实时荧光定量PCR方法2-------TaqMan法与目标序列互补TaqMan---水解型杂交探针

5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等

3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)

探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）

Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：

探针Tm为68-70℃，<30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段<400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：

一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度

72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM

探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同乙肝病人血液中HBV的绝对定量目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测设置对照：浓度为106、105

、104

、103

的标准样品各一个，设阴性和空白对照实验步骤：提取HBVDNA

设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序结果：获取血液样品中HBVDNA的精确copy数利用TaqMan法检测血液中的HBV数据分析分析结果：HBVDNA的精确copy数为

3.7X105利用TaqMan法检测血液中的HBVsamplesampleTaqMan法应用范围

起始模板的定量基因型分析产物鉴定单核苷酸多态性分析

(singlenucleotidepolymorphism，SNP)TaqMan法优缺点

对目标序列的高特异性

------阴性结果确定设计相对简单

------与目标序列某一区域互补重复性比较好优点

只适合一个特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针缺点实时荧光定量PCR方法3--Molecularbeacon法(分子信标)标记荧光的发夹探针环与目标序列互补茎由互补配对序列组成环茎荧光素淬灭剂发夹型杂交探针Molecularbeacon(分子信标)工作原理

荧光共振能量转移（FRET）探针与DNA杂交时产生荧光

-----延伸过程：不产生荧光

------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号Molecularbeacon(分子信标)应用范围

起始模板的定量基因型分析产物鉴定

SNP分析Molecularbeacon(分子信标)优缺点高特异性：对目标序列检测SNP最灵敏的试剂之一荧光背景低优点

只能用于一个特定目标设计困难价格比较高缺点几种方法总结化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应用范围SYBRGreenI结合于双链DNA的小沟中否复性/延伸熔解曲线分析定量和检测目标基因MolecularBeacon发夹型杂交探针有复性SNP分析定量和检测目标基因TaqMan水解型杂交探针（5‘-3’外切）有任何步骤SNP分析定量和检测目标基因实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA）病毒DNA或RNA的拷贝数转基因的拷贝数相对定量：计算初始反应模板的相对含量差异表达分析芯片评估转基因生物的检测基因型检测实时荧光PCR绝对定量方法unknown104103标准品，标准曲线已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线样品与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势敏感性高检测低拷贝数样品：单拷贝区分小差异样品：24，48，96，……大范围拷贝数样品同时检测100—1010省时有效实时荧光相对定量相对定量的目的比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）相对定量的问题解决样品材料不均一造成的差别解决加样过程中的差别内标基因内标通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小对目的基因进行均一化：目的基因拷贝／每一个内标基因拷贝实时荧光定量PCR法标准样品相对定量中的内标内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA和体外转录的RNA实时荧光定量PCR法定量方法

绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）

2-△C（t）双标准曲线法TaqMan法举例标记探针使用TaqMan探针进行双通道荧光定量Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针TaqMan法举例材料准备从正常乳腺组织中提取的总RNA从乳腺癌组织中提取的

总RNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线

ControlsnoRNA：阴性对照RNA+noreversetranscriptase：基因组对照TaqMan法举例反应程序RT-qPCR反应程序：50ºC,30min95ºC,15min94ºC,15sec60ºC,1minplateread10ºC,foreverEnd35moretimesTaqMan法举例癌症标记物表达Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2TaqMan法举例实验结果定量Copiesng/µlTotalRNAHealthyRNATumorRNATumor/HealthyERBB210951052213024922.16XGAPDH95500857301360001308001.45XTaqMan法举例实验结果定量分析ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.018/0.011GraphCopiesng/µlTotalRNATaqMan法举例实验结果讨论

通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍。QX200微滴式数字PCR介绍

*WhydoDropletDigital?1stGeneration2ndGeneration3rdGenerationGelElectrophoresisReal-TimePCRDropletDigitalPCR(qualitative)(indirectquantification)(absolutequantification)

Endpoint(0’sor1’s)

LesssensitivetoPCRefficiency

Nostandardcurve

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