不同水稻品种种子萌发特性及其与热稳定蛋白的关系

不同水稻品种种子萌发特性及其与热稳定蛋白的关系

所谓的“种子超干”是将成熟种子的含水量降至通常的安全含量以下（5%7%）。目前对超干种子在室温条件下贮藏可延长种子寿命的效果已基本取得共识。近年来的研究表明不同类型的正常型种子其耐超干的能力即耐脱水性存在差异,油料种子耐超干的能力强,它可忍耐极度的脱水,当种子含水量降低到2%以下种子活力不受影响,且耐藏性提高;淀粉类种子的耐脱水性在种间差异很大,如高粱、小麦、大麦种子耐脱水性较强,而水稻种子和大豆种子的耐脱水性在品种间存在较大的差异。Vertucci和Farrant指出种子耐脱水性可能是一种数量性状,与种子内蛋白质、脂肪、碳水化合物的积累呈正相关。Blackman等指出胚或胚轴在发育过程中获得耐脱水性时已经积累了一定量的包括贮藏蛋白质在内的热稳定蛋白,热稳定蛋白积累与种子耐脱水性呈正相关。但是有关种子成熟后的进一步脱水耐性以及在不同类型或同一类型不同种、品种之间这种脱水性存在差异性的原因及机理不清楚,至今未见报道。本文报道以籼稻、粳稻、杂交稻为材料,不同水稻品种种子的耐超干性差异及其与热稳定蛋白的关系,为阐明种子耐超干的机理奠定理论基础。1材料和方法1.1试验材料供试验用材料为不同品种的水稻(Oryzasativa),见表1,均为1999年收获的种子。1.2种子含水量和活力指数的测定采用硅胶干燥法,参照程红焱等的方法。将水稻种子置于尼龙网袋中,埋于干燥器内的硅胶中,硅胶与种子重量比为10∶1,20℃下脱水干燥,每天更换经120℃烘干冷却后的干硅胶。每隔一定时间称重,以制备不同含水量种子,将种子密封于双层铝泊袋中室温保存。种子含水量的测定按常规方法,参照参考文献。以发芽率和活力指数的大小表示种子的耐超干力差异。种子发芽前进行回水处理,具体参照朱诚等的方法。以胚根长至种子长的1/2定为发芽,重复3次。发芽指数(GI)=Σ(Gt/Dt);活力指数(VI)=GI×Sx。Gt:t天后的发芽数,Dt:发芽天数,Sx:发芽x天后的鲜苗平均重量。1.3-me、pmsf-sds-1、me-1,10.1%甘油-3-甲基苯磺酸酯cmf的制备取去壳含胚的半粒种子,于冷丙酮中研磨成粉,脱脂过滤,所得脱脂粉风干备用。热稳定蛋白的提取参照Blackman等和杨晓泉等的方法,略加修改。160mg胚轴或脱脂粉,加入600μL预冷的提取缓冲液(50mmol/LpH8.0Tris-HCl、500mmol/LNaCl、10mmol/L2-ME、1mmol/LPMSF),4℃冰浴研磨,10000×g冷冻离心20min,吸取上清液。沉淀再加入200μL提取缓冲液提取一次,合并上清液。取上清液于100℃水浴中煮沸10min,立即在冰浴中冷却15min,10000×g离心10min,取上清液加入4倍体积的冷丙酮(-20℃),于-20℃过夜沉淀蛋白,然后10000×g离心10min收集沉淀,贮于-20℃,用于电泳分析。取蛋白质沉淀加入200uL样品缓冲液(含50mmol/LpH6.8Tris-HCl、2%SDS、10%甘油、5%2-ME、0.1%溴酚蓝),100℃水浴3min,每泳道上样30μL,标准蛋白质分子量范围为14.4～97.4kD。凝胶的制备具体方法参见文献,浓缩胶的浓度为3%,分离胶的浓度为12%,采用恒压电泳,浓缩胶70V,分离胶150V。2结果与分析2.1种子发芽率和活力指数由表2可见,当种子含水量降至4.5%左右时,粳稻品种春江15和春江683的发芽率和活力指数均极显著地降低,而中香糯、杂交稻、籼稻J106和J174的种子发芽率和活力指数没有影响;当种子含水量降至3.5%左右时,中香糯、杂交稻、籼稻J106和J174的种子发芽率没有下降,但是中香糯和杂交稻种子的活力指数与对照相比分别呈显著和极显著降低。这一结果表明,籼稻品种(J174、J106)种子的耐超干能力强,粳稻品种(春江15、春江683)种子的耐超干能力差,而中香糯和杂交稻处于两者之间,说明不同水稻品种间的耐脱水性存在较大的差异,在进行种子超干时要特别小心。2.2杂交稻和硝化稻种子电泳图谱相比较由图1可见,不耐超干的粳稻品种春江15和春江683种子与耐超干的中香糯、杂交稻和籼稻品种J106及J174的种子热稳定蛋白的SDS电泳图谱相比较,两者之间有明显差异,主要表现在分子量为31～43kD的范围内,中香糯、杂交稻和籼稻均有一条36.3kD的特异性蛋白条带,而春江15和春江683种子则无。图2显示,当粳稻、中香糯、杂交稻和籼稻种子含水量从11%左右降低到3.5%左右时,该特异性蛋白条带差异仍然存在。图3显示,该36.3kD的蛋白条带在种子胚根突破种皮时也不消失。这表明水稻种子品种间的耐脱水性差异与该种子中是否存在特异蛋白质有一定的关系。3种子热稳定蛋白的差异本实验的结果表明,供试的粳稻品种春江15和春江683耐超干能力差,而籼稻、中香糯和杂交稻种子的耐超干能力较强,其中籼稻品种J106和J174的种子耐超干能力最强。近年来,对种子耐干机制的研究已从胚或胚轴脱水保护物质如胚胎发生后期富集蛋白(LEA蛋白)、热激蛋白与可溶性糖类等方面进行探讨。从本实验的不同水稻品种种子的热稳定蛋白SDS电泳谱带分析表明,中香糯、杂交稻和籼稻品种与粳稻品种春江15、春江683比较,两者之间存在明显的蛋白质谱带的差异,前者具有一特异性的蛋白质条带,分子量为36.3kD,而后者无此条带,这种差异性恰好与这些品种的耐超干能力强弱相一致,并且该蛋白质条带不随种子吸胀萌发而消失。可以推测这一特异性的热稳定蛋白(36.3kD)可能与种子的耐超干力相关。Blakman等和Bradford等已证实许多正常型种子在贮藏物质积累后期合成一类特殊的LEA蛋白,其水溶性和热稳定性可能与种子的耐脱水性有关,该类蛋白质的分子量大多数在10～30