侧柏叶总黄酮的质量控制

侧柏叶总黄酮的质量控制

侧柏叶是柏树科的一种干燥的侧柏叶。其性味苦涩、性寒,具有凉血止血、镇咳、平喘和杀菌等作用。其中的黄酮类成分被认为是侧柏叶的主要有效成分之一。目前侧柏叶总黄酮提取物在医药品、保健用品和保健食品领域中的应用广泛。最近研究证实,侧柏叶总黄酮具有α-糖苷酶抑制剂作用,是很有前途的Ⅱ型糖尿病降糖新药。前期试验对侧柏叶中总黄酮进行提取纯化工艺研究,并确定了“侧柏黄酮”的提取工艺。笔者主要对“侧柏黄酮”质量标准进行研究,以期为侧柏叶的进一步开发利用提供依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1研究的对象侧柏叶,购自长春市宏检药材公司。1.1.2主要设备UV-1701紫外可见分光光度计和SHIMADZU2010高效液相色谱仪,均购自日本岛津公司。1.1.3水和水质组成槲皮苷对照品,购自中国生物制品检定所;甲醇为色谱纯,购自美国Fisher公司;水为纯净水,购自杭州娃哈哈集团有限公司;穗花杉双黄酮对照品,自制,面积归一化法计算其纯度为99.64%,批号20080701;其他试剂为分析纯,购自北京化工厂。1.2方法1.2.1黄酮的总含量1.2.1.1.对照溶液的制备取槲皮苷对照品,精密称定,加无水甲醇制成浓度为0.1mg/ml的对照品溶液。1.2.1.2.样品溶液的制备称取侧柏叶总黄酮50mg,至50ml量瓶中,加无水甲醇溶解,定溶至刻度,摇匀滤过,取续滤液即得。1.2.1.3.选择探测波长槲皮苷对照品溶液经显色后,进行紫外扫描,在200～400nm进行紫外扫描,选择最佳测定波长。1.2.1.方法的回归方程①线性关系的考察。分别吸取不同浓度的槲皮苷对照品溶液,显色后,在428nm波长处测定吸光度,以吸光度对质量浓度进行线性回归,计算回归方程。②精密度的考察。取样品溶液显色后连续进行7次测定,记录吸光度值,以吸光度值计算RSD。③稳定性的考察。取样品溶液显色后,分别于0、10、20和30min处测定,记录吸收值,计算其RSD。④重现性考察。对同1批样品,独立进行6次测定,计算其RSD。⑤回收率试验。取已知含量样品6份,加入对照品适量,计算其平均回收率和RSD。1.2.1.含量测定和测定总氮的测定精密量取对照品溶液及供试品溶液各1ml,分别放入10ml容量瓶中,加入1ml浓度10%的三氯化铝甲醇溶液,用无水甲醇定容至刻度,摇匀后于428nm波长下测定吸光度,并计算含量。1.2.2测定了绥化山维斯黄酮的含量1.2.2.流动相、柱温度色谱柱为AgelaC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相为无水甲醇-水(60∶40,V/V);流速为1.0ml/min;检测波长为330nm;柱温为30℃;进样量为10μl。1.2.2.对照品溶液的制备取穗花杉双黄酮对照品,精密称定,加无水甲醇制成浓度为0.5mg/ml的对照品溶液,取1ml置10ml容量瓶中加无水甲醇定溶至刻度,得浓度为0.05mg/ml的对照品溶液。1.2.2.供试品溶液制备取40mg侧柏叶总黄酮,置50ml容量瓶中,加无水甲醇适量,超声处理10min,并用无水甲醇定容至刻度,摇匀,再吸取1ml置10ml容量瓶中,加无水甲醇定溶至刻度,摇匀滤过,取续滤液作为供试品溶液。1.2.2.标准曲线的绘制①专属性考察。取溶剂甲醇作为阴性对照溶液,在以上条件下,分别进样穗花杉双黄酮对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液,进行专属性试验。②线性关系的考察。分别吸取浓度为0.5mg/ml的对照品溶液各2.5、2.0、1.5和1.0ml,分别置10ml量瓶中,加无水甲醇至刻度,依次得到A、B、C和D,从D中吸取5ml至10ml量瓶,加无水甲醇定溶得E,再从E中吸取5ml至10ml量瓶,加无水甲醇定溶得F,吸取上述对照品溶液各10μl,分别注入液相色谱仪测定,记录色谱图,测定其峰面积,以峰面积为纵坐标(Y),穗花杉双黄酮进样量为横坐标(X),绘制标准曲线,并计算回归方程。③重复性考察。对同1批样品照供试品制备方法操作,独立进行6次测定,计算RSD。④精密度的考察。取样品40mg,按供试品制备方法,分别于0、2、4、8、12、24和48h依法测定,记录峰面积,计算RSD。⑤回收率试验。取同1批样品6份,每份20mg,置50ml容量瓶中,精密加入浓度为1.001mg/ml的穗花杉双黄酮对照品溶液10ml,按按供试品制备方法操作,得供试品溶液,测定,计算其平均回收率和RSD。1.2.3测量值对3批样品中总黄酮含量和穗花杉双黄酮含量进行测定。2结果与分析2.1黄酮的总含量2.1.1测量波长的选择计算得在波长428nm为有最大吸收,故选择该波长进行测定。2.1.2方法的稳定性和重现性①线性关系的考察。计算得回归方程为Y=62.25X+0.0186(R=0.9993)。试验结果表明,在0.00208～0.0208mg/ml范围内槲皮苷浓度与吸光度的线性关系良好。②精密度的考察。计算得吸光度的RSD为0.85%,表明该法重复性良好,方法稳定、可行。③稳定性的考察。计算得吸收值的RSD为0.73%,表明在30min内,供试品溶液稳定性良好。④重现性考察。计算得吸收值的RSD为1.69%,表明方法重现性良好。⑤回收率试验。计算得平均回收率为98.00%,RSD为1.98%,表明该方法准确可靠,可用于侧柏叶中总黄酮的含量测定。2.1.3测量值由表1可知,3批样品的总黄酮的平均含量为65.67%。2.2方法的回收率和精密度试验2.2.1方法学考察。①专属性考察。图1～3表明,在此条件下,穗花杉双黄酮峰分离良好,阴性对照液在相应位置无干扰。②线性关系的考察。计算得回归方程为:Y=4000000X-16844,R=0.9997。试验结果表明,在0.13～1.3μg/ml范围内,穗花杉双黄酮浓度与峰面积呈良好的线性关系。③重复性考察。计算得RSD为1.37%,表明方法重现性良好。④精密度的考察。计算得RSD为0.44%,表明在48h内,供试品溶液稳定性良好。⑤回收率试验。计算得平均回收率为99.266%,RSD为1.48%,表明该方法准确可靠,可用于侧柏叶中穗花杉双黄酮的含量测定。2.2.3含量测定。由表1可知,3批样品的穗花杉双黄酮150.967mg/g。3侧柏叶黄酮含量测定中有效点的确定目前侧柏叶黄酮被应用于药品、保健品以及日化