穗花狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻生长抑制及对微囊藻毒素mc-lr产生的影响

穗花狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻生长抑制及对微囊藻毒素mc-lr产生的影响

近年来，水体富营养化问题引起了人们的关注。如何有效控制和消除富营养化过程中藻类的急剧增加是亟待要解决的问题之一。在各种控藻技术中,利用具有化感抑藻能力的水生植物因其可分泌化感物质抑制藻类暴发,且在生长发育过程中可吸收大量营养物质有助于水生生态系统的修复和重建而备受青睐。相关研究发现狐尾藻(Myriophyllum)、金鱼藻(Ceratophyllumdemersum)、凤眼莲(Eichhorniacrassipes)、芦苇(Phragmitescommunis)等高等水生植物均能够分泌某些化感物质抑制浮游藻类的生长。其中狐尾藻是多年水生草本植物,因其能在富营养化水体中快速生长、生长发育过程中可吸收大量营养元素、具有良好的景观效果等优点,近来年被广泛用于污染水体的生态修复。目前研究多集中在水生植物活体对藻类的化感作用,较少针对收获后干燥的水生植物是否还具有化感作用进行探讨。现有的水生植物对藻类化感作用研究对于利用生态学方法控制藻类暴发性生长有重要意义,但在不适合种植水生植物的水域则表现出限制性。同时这种方法周期长,不能在短期内见效,也限制了其应用。而直接利用植物体内的化感物质可克服以上的缺陷。本实验主要利用干燥狐尾藻制备的狐尾藻浸出液,研究其浸出液对富营养化优势藻种铜绿微囊藻的化感作用,探讨其用于富营养化控制的可能性。由于许多引起富营养化的藻类是产毒的,故化感作用对藻类产生的藻毒素的影响直接关系到抑藻方法应用的生态安全。本研究在建立了实验室定量分析方法的基础上研究了狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻产生的主要毒素MC-LR含量的影响,而MC-LR是目前已知的毒性最强、危害性最大的微囊藻毒素。1材料和方法1.1m-11培养基狐尾藻买自官园花草市场。本实验所用狐尾藻为沉水植物穗花狐尾藻,被子植物,小二仙草科,狐尾藻属。购回后用自来水清洗干净,在M-11培养基中进行预培养,培养条件为自然光照,室温。其中M-11培养基如表1所示。铜绿微囊藻取自清华大学环境工程实验室,编号为FAKHB915,镜检铜绿微囊藻的纯度达到98%以上。培养条件为环境温度为28℃,光强为4500lx,光暗比为12h∶12h,M-11培养基。1.2合成树藻的浸出液实验狐尾藻浸出液的制备:取冲洗干净的狐尾藻80℃下烘48h后粉碎研磨。取1.0g粉末,加入100mL培养液,振荡提取48h,减压抽滤后定容至250mL即得浸出液。浸出液实验:分别取4L的藻类培养基加入3个5L的大烧杯中,按1×106cell/mL的初始密度接入纯的铜绿微囊藻。控制培养条件为:温度25℃,光照为4500lx。在培养到第7天时,其中2个烧杯中加入250mL的狐尾藻浸出液进行平行实验,另外1个烧杯加入250mL藻类培养基以作对照实验。分别于2009年5月及8月进行两次实验。数据按两次实验的平均值处理。1.3微生物和化感物质的提取藻密度:血球计数板法。测定藻密度时将水样搅匀后取培养烧杯上层,底层二个样测定,取二个测定值的平均值,以减小误差。水体中总氮、总磷:取10mL藻液,离心机(Feb-80,金坛医疗仪器厂)3500r/min下离心3min,根据其浓度大小取适量上清液,采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法(北京普析通用仪器公司T6新世纪型紫外-可见分光光度计)和过硫酸钾氧化-氯化亚锡还原钼蓝法(上海光谱仪器公司721E型分光光度计)测水中总氮、总磷。微囊藻毒素:取10mL藻液加入10mL甲醇,超声30min,离心10min(4℃,10000r/min)。取上清液以3mL/min的流速通过活化后的C18固相萃取柱富集,用10mL10%的甲醇、10mL蒸馏水淋洗后,用含0.1%三氟乙酸的甲醇10mL洗脱。洗脱液在60℃水浴条件下蒸发至0.5~1.0mL,用甲醇定容至5.0mL,置于-20℃下保存。微囊藻毒素的测定采用高效液相色谱法(美国Waters公司1505高效液相色谱仪)。色谱条件为150mm×3.9mm×5μm的C18反相柱;色谱柱温度40℃;流动相为甲醇与磷酸盐缓冲溶液(pH=3.0)按体积比57∶43混合;流速1mL/min;检测器紫外可见检测器波长238nm。化感物质的分离鉴定:取250mL的狐尾藻浸出液,过0.45μm的滤膜后,通过活化后C18的SPE小柱。加入10mL的蒸馏水淋洗后用纯乙醇洗脱其中的物质。洗脱液在40℃下旋转蒸发至近干后,用乙醇定容至2mL得水生植物的提取液。取1μL的狐尾藻提取液利用气质联机分析(美国VARIAN公司Saturn2100/MSn型GC-MS气质联用仪)。分析条件为30m×0.25mm×0.25μm的VF-5柱子;升温条件为50℃保持2min,以6℃/min升温到270℃,保持10min;进样口温度为260℃;进样量为1μL。2结果与分析2.1生物活性物质对藻细胞生长和形态的影响铜绿微囊藻藻密度的含量如图1所示。藻类的生长基本符合S型生长曲线。当添加狐尾藻浸出液后,受到化感作用的影响,其生长曲线发生改变,实验中狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻表现出抑制作用。图1显示了狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻生长过程中藻密度的影响。实验前期(未加入狐尾藻浸出液)随着时间的延长,藻密度呈逐渐缓慢增加趋势。实验在第7天添加狐尾藻浸出液后,狐尾藻浸出液中的化感物质抑制了藻类的生长,藻密度的值迅速从11.5×106cell/mL下降7.5×106cell/mL,且一直保持下降趋势,直至第12天藻密度仅有1.5×106cell/mL。而对照组的藻密度值却一直保持增长的趋势。结果表明狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻的生长有明显地抑制作用。将加入狐尾藻浸出液后的藻密度代入抑制率的公式:抑制率(%)=(对照组藻密度-实验组藻密度)/对照组藻密度×100。得出其抑制率如表2所示。实验第10天对铜绿微囊藻进行镜检(日本OLYMPUS公司BX51型显微镜,扩大倍数×400)的结果如图2所示。添加狐尾藻浸出液的水体在化感物质的影响下,大多数藻细胞静止不动,体积增大几乎肿胀成圆形,细胞膜结构有所损坏,细胞颜色变淡甚至变成白色。由此推测,在化感物质的作用下,受到抑制的藻细胞体积增大,藻细胞呈融解状态。与舒阳等研究凤眼莲浸出液抑藻作用中镜检观察的形态相似。胡洪营等曾指出化感物质会破坏藻细胞膜,改变了藻细胞膜中磷脂脂肪酸的结构,由于细胞膜中磷脂脂肪酸的种类与组成直接影响着细胞膜的流动性和选择透性,导致细胞质渗出。2.2总磷含量的变化为排除营养抑制对化感抑制的影响,本实验采用了较高的营养盐浓度,以保证实验过程中藻类生长对营养盐的需求。狐尾藻浸出液对培养液中总氮、总磷含量的影响如图3、4所示。图中数据显示直至实验后期实验组水体中营养盐的浓度仍保持较高的水平,能满足藻类生长的需要。进一步地证明实验组藻类生长的抑制是植物化感物质的抑制作用。实验过程中总磷的变化过程如图4所示。第7天添加狐尾藻浸出液后,水中总磷的含量从3.494mg/L下降到3.467mg/L,下降了0.027mg/L。而此过程中对照组水中总磷含量总体下降了0.017mg/L。分析可能是由于藻类的大量死亡,使磷元素伴随着藻类的碎屑颗粒沉积下去。分析实验组与对照组的总氮、总磷含量的变化,表明添加狐尾藻浸出液并没有对水中总氮总磷的含量产生较大影响。植物浸出液的化感作用并不能有效地减少水中的氮磷等营养元素的含量。2.3生物毒素的含量标样及水样的MC-LR液相色谱图如图5、6所示。其中图5中出峰时间为3.730min对应的是MC-RR,出峰时间6.317min对应的是MC-LR。图6中出峰时间为6.330min的对应的是水样中的MC-LR。说明本实验培养的铜绿微囊藻产生的毒素以MC-LR为主。实验过程中每隔一天测定水样中藻毒素。其MC-LR的含量如表3所示。从表3中可以看出,对照组的藻毒素含量随着时间的延长升高,而后期藻毒素有少量下降。数据变化可以看出,随着时间的延长,藻类迅速繁殖,故其释放的藻毒素也随之升高。而到实验后期,虽然藻类开始死亡,藻类在死亡后细胞破裂仍能产生一定的藻毒素,故藻毒素的含量仍保持在一个较高的水平中,这与文献的研究结果一致。第7天加入狐尾藻浸出液后,由于藻毒素是一种细胞内毒素,狐尾藻浸出液中的化感物质抑制了铜绿微囊藻的生长,其可产生藻毒素的藻细胞数量大大减少,对应的藻毒素含量也应有所下降。其中MC-LR的含量从第4天的0.095μg/mL下降到第12天的0.050μg/mL。对应的抑制率见表4。可以看出,狐尾藻浸出液中的化感抑制了其微囊藻毒素MC-LR的产生。Jones等研究了使用硫酸铜杀藻剂处理水华水体后,水体中的MC-LR的变化情况。结果表明MC-LR的含量显著上升。对于使用化学杀藻剂抑藻,虽能在短时间内起到显著的杀藻效果,但同时也引起了藻细胞死亡后藻毒素的大量释放,从而使水中的藻毒素浓度迅速上升,影响水质安全,与此相对比,本实验使用水生植物浸出液抑藻,在有效地控制藻类大量繁殖的同时不会促进藻类死亡后藻毒素的释放。2.4羟基苯甲酸酰甲基对狐尾藻浸出液提取的物质GC-MS分析,其气相色谱图及质谱图之一如图7、8所示。其包括的可能物质有:邻二甲苯;环庚三烯;邻苯二酚;3-甲基-1-丁醇;对羟基苯甲酸;环氧丙烷;3,4,5-三羟基甲酸;2-乙基-1-己醇等。其中Nakai等从穗状狐尾藻中成功分离出邻苯二酚(又名儿茶酚)和3,4,5-三羟基甲酸(又名五倍子酸),并证实其对铜绿微囊藻具有强抑制作用。另有文献指出对羟基苯甲酸对铜绿微囊藻有化感效应。狐尾藻中抑制铜绿微囊藻生长的化感物质是一种还是多种物质共同作用,还需要对化感物质进行进一步的分离和测定,化感物质的微观作用机制也有待于进一步研究。3相对生物活性物质与总氮总磷含量关系本文实验表明,狐尾藻浸出液对铜绿微囊藻的生长及藻毒素MC-LR的产生都有一定程度上的抑制作用。其中对铜绿微囊藻具有较强的生长抑制能力,抑制率最高可达91.89%。在添加狐尾藻浸出液后,不仅能有效地抑制藻类的生长,且能较好地抑制藻毒素MC-LR的产生,其对MC-LR产生的抑制率可高达71.26%。但狐尾藻浸出液对水中总氮总磷含量基本无明显影响。通过对狐尾藻浸出液提取物质GC-MS分析可以看出,其可能含有的物质中可能包含的邻苯二酚、3,4,5-三羟基甲酸及对羟基苯甲酸等物质对铜绿微囊藻都有明显地抑制作用。本研究结果证实水生植物