e-oh调控系统和crelolex基因剔除系统双重调控hcvns3aa丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠的建立

e-oh调控系统和crelolex基因剔除系统双重调控hcvns3aa丝氨酸蛋白酶三转基因小鼠的建立

目前，世界上近3%的人口感染了丙类肝炎病毒（hcv）并进展缓慢。慢性丙肝炎（chc）是肝损伤、肝硬化和肝癌的主要原因。HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶在病毒编码蛋白前体的加工、成熟过程中起重要作用,因此与病毒复制密切相关。不仅如此,NS3/4A蛋白酶还与宿主细胞内一系列固有免疫相关蛋白相互作用,从而改变或阻断重要的抗病毒固有免疫通路,在HCV逃避固有免疫的过程中发挥至关重要的作用。因此,针对NS3/4A蛋白酶的特异抑制剂不仅能有效阻断病毒的复制,而且有助于感染者体内固有免疫反应的重新恢复。然而,由于HCV的宿主狭窄性,至今都未能建立合适的HCV感染小动物模型,这不仅阻碍了针对NS3/4A蛋白酶作用机理的深入研究,也使特异性抑制剂筛选、评价都仅仅停留在细胞水平。目前,普遍认为较适合作为小动物感染模型的人肝脏嵌合的免疫缺陷小鼠显然不适于研究NS3/4A蛋白酶与宿主免疫系统的相互作用,而传统的转基因小鼠模型也因免疫系统对靶蛋白的终身免疫耐受而无法进行类似研究。我们在前期研究的基础上,通过联合应用Tet-on四环素调控系统和Cre/loxP基因剔除系统,建立了严格可调控型表达HCVNS3/4A丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠模型,以期能同时弥补以上两类模型的不足,为NS3/4A蛋白酶在体内的作用机制和抑制剂的筛选、评价奠定基础。1材料和方法1.1cre重组酶及ss3/4g-b治疗Lap/LC-1双转基因小鼠、Lap/NS3/4A双转基因小鼠分别已由本室建立,2种双转基因小鼠各自含有完整的Tet-on调控系统。如图1所示,Lap/LC-1双转基因小鼠基因组携带Lap和LC-1转基因片段,LAP转基因片段在肝脏组织组成型转录、翻译产生的反向四环素调控转录激活因子(rtTA),但只有与外源性多西环素(doxycycline,Dox)结合形成的复合物与Tet-on双向启动子结合后,才可启动LC-1转基因片段的转录,进而翻译产生Cre重组酶及萤光素酶。Lap/NS3/4A双转基因小鼠基因组携带Lap和NS3/4A转基因片段,其Lap转基因片段在肝组织中组成型表达的rtTA也只有与Dox结合形成复合物后才能与NS3/4A转基因片段内的Tet-on启动子结合而启动转录,并终止于NS3/4A基因上游的BGHpolyA处,因而只翻译产生萤光素酶而不产生NS3/4A蛋白酶。PCR试剂(包括rTaqDNA聚合酶、10×PCR缓冲液、dNTP、DL2000DNAmarker、DNA电泳10×上样缓冲液等)为TaKaRa公司产品;多西环素为Sigma公司产品;萤光素(D-luciferin)为CaliperLifeSciences公司产品;Cre重组酶兔源一抗为Merck公司产品;NS5B蛋白鼠源一抗由本室制备。PCR扩增仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳成像系统均为Bio-Rad公司产品;在体生物发光成像(invivobioluminescentimaging,BLI)采用CaliperLifeSciences公司的XenogenIVISKinetic系统。1.2引用材料的设计与合成根据引物设计原则,以基因组DNA为模板扩增转基因片段(部分)的引物序列见表1,由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。1.3基因组dna的提取和鉴定选取6~8周龄、已分别经PCR和BLI鉴定为强阳性的双转基因小鼠Lap/LC-1与Lap/NS3/4A双转基因小鼠交配,子代鼠3~4周龄时剪趾编号并收集,常规方法提取基因组DNA,PCR法分别鉴定Lap、LC-1和NS3/4A转基因片段。Lap和LC-1片段的PCR扩增条件为94℃50s、55℃30s、72℃30s,共30个循环;NS3/4A片段的PCR扩增条件为94℃50s、55℃50s、72℃2min,共30个循环。初检完成后,再次从子代鼠剪尾收集、提取基因组DNA、PCR鉴定后完成复检。Lap、LC-1和NS3/4A转基因片段均阳性的三转基因基因小鼠予以保留。1.4小鼠材料白砂糖液经PCR鉴定的三转基因小鼠随机分组并以Dox进行诱导:实验组以Dox饲喂,Dox溶液浓度为1mg/mL,并含50g/mL白砂糖;对照组只以50g/mL白砂糖液饲喂。连续饲喂8d后小鼠腹腔注射萤光素(萤光素酶底物),剂量以小鼠体重为参考标准(150mg/kg)。注射萤光素的小鼠在麻醉后置于BLI系统内,检测体内萤光素经萤光素酶催化反应后产生的发光信号,成像阳性的小鼠予以保留并做以下分析。1.5叶片的诱导表达将上述成像阳性的小鼠处死,并分别取肝脏、肾脏、心脏等组织,迅速置于4%中性甲醛液中固定,常规包埋、切片,切片再经常规二甲苯脱蜡、乙醇梯度复水、外源性过氧化氢酶灭活、抗原热修复,用10%羊血清于37℃孵育30min,用Cre重组酶一抗于4℃孵育过夜,用HRP标记的抗兔二抗于37℃孵育60min,DAB显色,苏木精胞核衬染,经乙醇梯度脱水、二甲苯透明后以中性树胶封片;NS3/4A蛋白的免疫组化显色同法进行。2结果2.1ns3/4g、lap及lc-1基因突变片段的表达情况以2种双转基因小鼠杂交后所产子代小鼠的基因组DNA为模板进行PCR鉴定,部分小鼠的鉴定结果如图2。在所有已检测的子代小鼠中,NS3/4A、Lap及LC-1转基因片段的阳性率分别约为42%、81%和53%,NS3/4A、Lap及LC-1转基因片段均为阳性的小鼠约占15%。NS3/4A、Lap双阳性小鼠和Lap、LC-1用于三转基因小鼠的制备。这种三转基因小鼠的制备、筛选方式更契合实验动物使用的“3R”原则。2.2dox对小鼠n3/4基因型的检测上述经PCR鉴定得到的3个转基因片段均为阳性的小鼠肝细胞内即构成完整的Tet-on调控系统和Cre/loxP基因剔除系统,如图3所示,Lap转基因片段虽能组成型表达rtTA,但是在肝细胞中不存在Dox时,rtTA无法与NS3/4A、LC-1转基因片段上的四环素调控元件结合,因而无法启动下游基因(luc、cre)的转录;但当存在Dox时,rtTA与Dox形成复合物,进而能够分别特异性结合于NS3/4A、LC-1转基因片段上的四环素调控元件,从而启动转录,翻译产生萤光素酶和Cre重组酶,而Cre重组酶与NS3/4A转基因片段上的loxP位点特异性结合并切除之间的片段(含luc基因及BGHpolyA),此后NS3/4A转基因片段转录产生的mRNA才包含NS3/4A蛋白基因编码区,因而翻译产生NS3/4A蛋白酶。因此,三转基因小鼠只有经Dox饲喂后,在Tet-on调控系统和Cre/loxP基因剔除系统的严格调控下,才能在肝细胞内产生NS3/4A蛋白酶。上述经PCR鉴定得到的3个转基因片段均为阳性的小鼠在经Dox饲喂1周后进行在体生物发光成像,部分成像结果如图4。在Dox饲喂前成像,所有小鼠均未检测到发光信号;饲喂1周后,所有实验组小鼠均检测到明显的发光信号,而对照组未检测到任何发光信号。2.3cre重组酶、hcvns3/4g信号分析将经Dox诱导、BLI成像阳性的小鼠处死后取组织,分别进行免疫组化、Western印迹分析。结果显示,Cre重组酶和HCVNS3/4A蛋白酶特异性表达于肝细胞,Cre重组酶定位于肝细胞胞核,而NS3/4A蛋白酶分布于肝细胞胞浆。免疫组化结果见图5、6。3新型基因敲除系统的建立目前,大部分HCV转基因小鼠模型都不能对目的基因进行条件性表达,即小鼠组成型表达外源基因,使小鼠对HCV结构蛋白或非结构蛋白终生处于免疫耐受状态,这与HCV自然感染后宿主体内产生外源性的HCV蛋白的情况差异较大。HCVNS3/4A蛋白酶除了在病毒蛋白前体加工、成熟过程中发挥重要作用外,同时还通过切割多种宿主抗病毒相关蛋白的方式,在HCV逃逸固有免疫反应的过程中扮演重要角色。因此,制备对NS3/4A蛋白酶严格可调控、肝靶向表达的新型转基因小鼠模型,有助于在体内水平更深入研究HCVNS3/4A蛋白酶与宿主相互作用的机制及HCV免疫耐受的机理。目前的HCV抗病毒抑制剂筛选模型主要是基于Huh7细胞系的HCV复制子系统(HCVreplicon)和HCV细胞培养系统(HCVcc)。然而两者所用的细胞系均源于肝癌细胞,其基因表达谱、信号通路、抗病毒反应,以及胞内药物代谢酶类、代谢途径等均与正常在体细胞不同,因此用其作为药物筛选模型的可靠性不高。一些在体内正常发挥作用时首先需要代谢活化(如磷酸化作用)的抗病毒候选分子,在培养细胞系试验时可能由于缺少前期的活化而使筛选结果呈阴性;另外,一些在培养细胞系试验时筛选结果呈阳性的候选分子应用于体内时,亦有可能经前期的代谢作用而无法在靶组织发挥抗病毒作用,即体内试验呈阴性。正是由于小动物实验模型的缺乏,目前仅有2类抗NS3/4A蛋白酶的抑制剂进入Ⅲ期临床试验阶段。因此,建立严格可调控、肝靶向表达NS3/4A蛋白酶的转基因小鼠模型,也有助于HCVNS3/4A蛋白酶抑制剂的筛选、评价。本研究室前期已经建立了2种双转基因小鼠,各自含有完整的Tet-on调控系统,其Cre重组酶及萤光素酶肝靶向性和可调控性均良好。但是,已有研究证实,Tet-on调控系统在不使用Dox时,仍存在很低水平的外源蛋白的漏过性表达。因此,在本研究中,我们根据2种双转基因小鼠分别含Cre重组酶、Cre重组酶的特异性识别、剪接的loxP位点的特点,将2种小鼠杂交获得三转基因小鼠,三转基因小鼠体内构成完整的Tet-on诱导调控系统和Cre/loxP基因敲除系统。三转基因小鼠在未经Dox诱导时,NS3/4A转基因片段独特的结构将非诱导性的转录终止于NS3/4A开放读框上游的BGHpolyA处,因而使漏过性表达仅涉及NS3/4A开放读框区上游的萤光素酶开放读框。综上,我们初步建立了Tet-on诱导调控系统和Cre/loxP基因敲除系统双重调控表达HCV丝氨酸蛋白酶的三转基因小鼠。该小鼠只有在Dox持续诱导的条