竹柏叶hplc特征指纹图谱研究

竹柏叶hplc特征指纹图谱研究

竹柏树又称红松、罗汉柴、椰子、山脚下、铁甲树等。这是罗汉松科的一种常见树种，分布在广东省南部，生长于广东省大部分地区。近年来,竹柏的抗肿瘤作用日渐引起人们的注意,在竹柏的分类学和叶的挥发油方面也进行了一些研究,竹柏种子中所含竹柏内酯A、1-去氧-2β∶3β-环氧竹柏内酯A、1-去氧-2α-羟基竹柏内酯A有较强的细胞毒性作用,此外,笔者参与了竹柏类植物的生药学相关研究。竹柏除了含挥发油外,其黄酮类成分也是最主要的有效成分。黄酮类成分包括穗花杉双黄酮、金松双黄酮等,其中穗花杉双黄酮的含量在竹柏叶化学成分中含量较高。本研究以穗花杉双黄酮作为对照品,采用超声醇溶液提取,对采集到的8批竹柏叶中的醇提物进行特征图谱研究,并应用国家药典委员会推荐的分析软件,对8个样品中的醇溶成分进行中药指纹图谱鉴别分析。初步得到不同批次竹柏叶中醇溶部分各成分的相对含量状况,现报道如下。1材料表面1.1仪器和试剂盒2方法和结果2.1仪器、试药和仪器BS124S电子分析天平和BS211p电子分析天平(德国Sartorius公司);HWS-28电动恒温水浴锅(上海一恒电子仪器厂);Agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司);TCQ-250型超声清洗器(北京医疗设备二厂)。穗花杉双黄酮对照品由广东省中医研究所提供,纯度为99.8%;乙腈为色谱纯,磷酸、甲醇等均为分析纯,水为三蒸水。1.2检测部位和温度竹柏采集于广东省广州市,原植物经蔡岳文主任中药师鉴定分别为罗汉松科竹柏Podocarpusnagi(Thun.)ZolletMor和长叶竹柏。采集部位为叶,采集时间为2007年10月30日。AgilentHypersilODSC18柱(4.6mm×150mm,5μm);以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱,乙腈由15%~100%;洗脱时间30min,检测波长为310nm。流速1.0mL/min,柱温20℃。理论塔板数按穗花杉双黄酮计应不低于5000。2.2供试品溶液的制备取药材样品,剪碎,取约0.5g,精密称定,置50mL具塞锥形瓶中,加体积分数50%乙醇10mL,称质量,超声提取30min,取出,置冷,称质量,补足损失的质量,摇匀,用0.22μm微孔滤膜滤过,滤液做为供试品溶液。2.3对照溶液的制备精密称取穗花杉双黄酮对照品适量,加甲醇溶解,配制成浓度为0.013mg/mL的对照品溶液。2.4方法研究2.4.1精密度实验结果取同一供试品溶液,连续进样6次,其相对保留时间稳定,主要共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差(sR)均小于2.9%,结果表明精密度较好。2.4.2供试品溶液稳定性取同一供试品溶液,分别于0、1、2、3、4、24h检测,其相对保留时间稳定,主要共有峰相对保留时间sR和相对峰面积sR均小于3.2%,结果表明供试品溶液24h内稳定性好。2.4.3重现性测定取同一样品号的供试品6份,分别处理测定,其相对保留时间稳定,主要共有峰相对保留时间sR和相对峰面积sR均小于3.6%,结果表明重现性良好。2.5结果2.5.1指纹图谱的建立指纹图谱建立的原则应从色谱的整体性出发,确定能构成指纹图谱的色谱峰的峰号、峰位、峰数。经比较所有测定和记录的色谱图,确定竹柏叶样品的共有峰组成其指纹图谱,同时找出主要特征指纹峰。对照品、供试品HPLC图谱见图1。2.5.2指纹色谱检测按供试品制备方法分别对竹柏叶(8个样品)进行处理测定,以穗花杉双黄酮对照品峰(S)为参照峰(见图1),分别进行指纹色谱峰标号,标示出8个竹柏药材有21个共有峰,见图2。2.5.3指纹图谱的特征以穗花杉双黄酮色谱峰(保留时间RT为12.01min)为标准峰,对各个样品指纹色谱进行分析。在竹柏叶方面,从保留时间上看,8个竹柏叶样品指纹图谱相似程度很高,共有峰有21个;从整个图谱看,各个色谱峰分离度高,基线平,色谱峰特征性强,8个竹柏叶样品指纹图谱图貌比较相似,特别是在第二区间(RT=10.00~25.00min)。但不同样品之间也存在差异,主要表现在第一区间(RT=1.00~10.00min)。2.5.4.1.竹白叶8个样品的指纹相似性分析图3(见彩图页第497页)结果显示:指纹图谱相似程度很高,特别是在第二区间(RT=10.00~25.00min)。2.5.4.2.竹白叶8个样品的指纹相似度分析以13号峰(穗花杉双黄酮峰)为参照,得各峰值及均值,结果见表1、表2。3讨论3.1色谱柱的分离和色谱经试验比较,以乙腈—体积分数0.05%磷酸水溶液为流动相,梯度洗脱能够较好地使竹柏叶样品中各色谱峰分离,且出峰最多,基线较平,分析时间30min。3.2指纹图谱的确定考察了不同波长如280、310、340nm等的指纹图谱,同时还对数批样品进行测定,结果表明:不同波长指纹图谱存在差异,以280nm的指纹图谱所得信息最多,但基线不够平整;而310nm和340nm的色谱图则较为平整,且吸收峰分离度好,塔板数均很高,尤以310nm的分析图谱最好。3.3洗脱条件及洗脱效率由于梯度洗脱能改善峰分离程度,对不同洗脱梯度进行考察,结果表明:以上述洗脱条件最好。柱温对分离影响也很大,经过考察,柱温以25℃为最佳。3.4相关系数的比较8批竹柏叶样品HCLP图谱中,共有峰有21个,指纹图谱相似程度很高,但不同样品之间也存在差异,主要表现在第一区间(RT=1.00~10.00min)。从中位数相似度评价看,竹柏叶指纹图谱相关系数(中位数)和相合系数(中位数)均在0.9000以上,除了个别较低[竹柏叶6相关系数(中位数)为0.8913,竹柏叶2相合系数(中位数)为0.8544]外。同样,从均值相似度评价看,竹柏叶指纹图谱相关系数(均值)和相合系数(均值),除了竹柏叶2相合系数(均值)为0.8735外,也均在0.9000以上。指纹图谱相似度评价结果显示:8批竹柏叶之间指纹图谱相似度较高,达到了0.9以上,表明指纹图谱可做为竹柏叶的鉴别特征和质量评价指标之一。竹柏叶分布广泛,生长周期也长,本研究对其指纹图谱研究所用样品仍不够多,因此,