复合酶对草鱼selavolvamer的半纤维素酶的影响

复合酶对草鱼selavolvamer的半纤维素酶的影响

随着人口的增加和资源的消耗，可再生资源的开发和利用已成为一个共同关注的问题。在植物生长发育的产物中，半纤维素是颗粒和养分中的主要碳氢化合物。例如，杆重量的25%-50%半纤维素是可再生资源的另一个重要因素。半纤维磷酸酶是提取和提取植物中的其他成分的一个重要问题。同时，一些半纤维素酶可以广泛应用于食品加工、低聚糖制备、食品加工、纸浆溶解、纸浆糊等。草，又名马鞭草和伞状草，位于中国南方，具有很高的营养价值。它是世界上第五大重要的经济栽培品种。草主要生长在草质纤维中，能有效分解纤维和半纤维素。因此，这些酶系的研究对于草质纤维的开发和利用具有重要意义。这只是诱导、分布和重新定位半纤维素酶系。1材料和方法1.1药物、试剂和仪器主要试剂购于美国SIGMA公司,包括:木聚糖(xylan,frombirchwood),果胶,p-nitrophonyl-α-L-arabinofuranoside,p-nitrophonyl-β-xyloside,p-hydroxybenzoicacidhydrazide(PAHBAH),phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF);其它试剂:羧甲基纤维素(CMC)购自中国医药集团上海化学试剂公司;3-(N-Morpholino)propanesulfonicacid(MOPS)购于上海申能博彩有限公司.UV-2000分光光度计(UNICO),IECmultiry高速冷冻离心机(ThermoIEC).1.2种子培养基和摇瓶培养基草菇(Volvariellavolvacea)菌种:由南京师范大学何强泰先生惠赠.种子培养基:蔗糖20g/L,KH2PO40.6g/L,MgSO40.5g/L,VB10.5mg/L,琼脂20g/L.摇瓶培养基:各种不同的碳源10g/L,KH2PO40.6g/L,MgSO40.5g/L,VB10.5mg/L.1.3蘑菇的生长和粗酶的制备1.3.1蘑菇1种子在37℃静止培养4～5d,摇瓶于37℃,200r/min培养4～5d.1.3.2离心除杂液制备将草菇的摇瓶培养液用尼龙布过滤,取滤液;在4℃以9600r/min离心10min,取上清液;用80%饱和度的硫酸铵在4℃沉淀并平衡2h,在4℃以9600r/min离心10min,取沉淀;用适量的pH6.5的MOPS溶解,所得的溶液即胞外酶液.1.3.3mops的匀浆将草菇的摇瓶培养液用尼龙布过滤,取菌丝体;用25mmol/LpH6.5的MOPS洗3遍后,将菌丝体在4℃用匀浆器匀浆10min,加入适量的pH6.5的MOPS得到匀浆液;在4℃以9600r/min离心10min,取上清液,即得到胞内酶液.1.4酶活性测定1.4.1mops-pahbahv的合成100μL质量分数0.5%的木聚糖,酶液20μL25mmol/L,pH6.5的MOPS反应5min,结束后,加600μL终止剂/显色剂PAHBAH[配方为:V(0.5mol/LNaOH):V(溶于0.5mol/LHCl的质量分数为5%PAHBAH)=4∶1],沸煮10min,冷却后测A410值.1.4.2rophonyl--xylo创造取30μL的酶液,加10μL20mmol/L的p-nitrophonyl-β-xyloside,加160μL的25mmol/LpH6.5的MOPS,45℃反应30min,再加入700μL1mol/L的Na2CO3终止反应,测A405值.1.4.3hocyl--l-arab内即:4-3,5-三甲基-5,5-三甲基-5,5-三甲基-5,5-甲基-5,5,5-甲基-5,5,5,5-特征参比hocyl-4e,4e的合成取30μL的酶液,加10μL25mmol/L的p-nitrophonyl-α-L-arabinofuranoside,加160μL的25mmol/LpH6.5的MOPS,45℃反应30min,再加入700μL1mol/L的Na2CO3终止反应,测A405值.1.4.4酶单位u的定义1在该反应条件下,1min内催化产生1μmol产物所需的酶量.1.5酶属性的测定1.5.1最合适反应温度的测量1在20～80℃范围内,每隔5℃,分别测定酶活.以酶活最高为100%,计算相对酶活.1.5.2计算相对活性在不同的pH条件下分别测定酶活,以酶活最高为100%,计算相对活性.在pH3.8～5.8范围内,缓冲液是50mmol/L邻苯二甲酸氢钾缓冲液,在pH5.8～8.0范围内,缓冲液是50mmol/L磷酸缓冲液.1.5.3温度值的测定在相对稳定的pH条件下,使酶在某个温度下保温不同的时间,再测定相对酶活,以未保温(4℃保存)的酶样活性为100%,确定酶的半衰期为1h的温度值.1.5.4ph稳定1酶在不同的pH条件下保温相同的时间,分别测定残留酶活性与不保温的酶活比,计算百分比.缓冲液的选择参考1.5.2方法.2结果与分析2.1木聚糖酶的组成半纤维素酶系中的木聚糖酶主要是胞外酶,木糖糖苷酶是胞内酶,阿拉伯糖苷酶胞内、胞外都有(见表1).这样的分布与酶的催化作用有一定的相关性,木聚糖酶是内切酶,主要作用于木聚糖主链,因为木聚糖主链很难进入细胞膜,所以木聚糖酶主要分布在胞外.木糖糖苷酶主要分解低聚木糖,产生菌体能直接利用的糖,因此木糖糖苷酶主要分布在胞内.而阿拉伯糖苷酶主要是分解侧枝,与木聚糖酶和木糖糖苷酶有协同作用,因此胞内、胞外都有.研究中木聚糖酶的主要诱导因子是木聚糖,木糖糖苷酶的主要诱导因子也是木聚糖;阿拉伯糖苷酶是木聚糖、CMC、果胶混合诱导.2.2反应的最佳条件2.2.1反应温度1最合适的温度由图1可以看出,半纤维素酶系中的木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的最适反应温度是60℃,木糖糖苷酶的最适反应温度是55℃.2.2.2最合适反应ph1由图2可知,阿拉伯糖苷酶的最适反应pH是5.0,木聚糖酶的最适反应pH是5.8,木糖糖苷酶的最适反应pH是6.6.2.3酶的稳定性2.3.1木聚糖酶的测定由图3可以看出,阿拉伯糖苷酶在pH4.6～6.6时都比较稳定,在pH5.8时最稳定;木聚糖酶在pH5.0～7.4比较稳定,在pH5.8时最稳定;木糖糖苷酶在pH5.8～7.4比较稳定,在pH7.0时最稳定.2.3.2糖苷酶半衰温度的测定由图4可知,半纤维素酶系中的阿拉伯糖苷酶保温1h,酶活的半衰温度为60℃,木聚糖酶的半衰温度为52℃,木糖糖苷酶的半衰温度为55℃.3半纤维素酶系统草质纤维是一个复合结构,其中木质素由芳香烃衍生物以C—C键和—O—键纵横交联在一起,其侧枝又与半纤维素结合形成一个十分致密的网络结构,将纤维素紧紧包裹在里面,所以要降解纤维素,必须先降解木质素和半纤维素.目前,国内对半纤维素酶的研究集中在对木聚糖酶的研究,而对阿拉伯糖苷酶和木糖苷酶研究还较少,对于这两种酶酶学特性的研究,将有利于我们对草质纤维的有效降解及对半纤维素酶的有效应用.草菇有降解半纤维素的一整套酶系统.使用不同