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文档简介

免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验流程

1.样品制备

2.组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定

3.组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构

4.切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态

5.脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。

6.抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。

7.非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。

8.样品染色

一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。二抗一般室温孵育30min。

底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。

复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。

免疫组化实验常见问题分析

1.IHC实验结果显色过深

一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间

孵育温度过高——选择4℃或室温孵育

2.实验结果存在非特异性显色

石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间

蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间

组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭

3.实验结果显色弱或无染色

一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间

组织中无目的抗原的表达：一抗种属来源与二抗不匹配

免疫组化实验注意事项

切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。

一抗的冲洗原则：单独冲洗，防交叉反应污染；温柔冲洗，防止切片脱落；可采用浸洗方式。

有条件的话立即拍照，若不能及时拍照，也要封好

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