浓香型白酒窖泥微生物丰度的研究

浓香型白酒窖泥微生物丰度的研究

甲壳动物是有效的酒精转化手段。浓香酒是在泥池中发酵的。井中粘土的感官、理化性质、微生物种类和丰富对浓香酒的发酵、成功和质量起着非常重要的作用。实践表明，在旧木材中，靠近环土中近井底部的酒渣喝酒的质量最好，其次是环壁，中间的混乱和上层的相对较差。随着窖池使用年份的延长,窖泥可能会朝着老熟或老化两个方向发展,管理得当,则趋于老熟,否则会趋于老化.老熟窖泥和老化窖泥在感官上已有大量经验总结,在理化分析、护窖以及人工老窖上已有一些研究和应用.应用分子生物学的手段分析窖泥微生物区系来探索某种微生物与窖泥质量的内在关系也已有一些研究.王明跃等通过对窖泥微生物16SrDNA系统发育关系分析,得到窖泥微生物多样性随窖龄增加而增加的结论.施思等利用PCR-DGGE技术分析对比了大曲酒醅不同部位的微生物群落结构及多样性.罗惠波等利用PCR-SSCP技术研究了不同窖龄浓香型白酒窖池细菌群落的变化规律.何翠容等使用FISH法,研究得到了浓香型白酒窖池中窖泥的细菌、古菌数量随窖龄延长而增加的结论.这些分子生物学方法中,16SrDNA系统发育关系分析、PCR-DGGE技术以及PCR-SSCP技术,通常只用来分析窖泥微生物的多样性,不足以定量分析.而FISH法不能达到100%杂交,测得值会比真实数值偏小.实时荧光定量PCR技术作为一种核酸定量的手段,以其高灵敏性、高特异性、高精确度、实时性、可重复性、操作简便等优点,在微生物生态学中逐渐得到广泛的应用[11,12,13,14,15,16,17].李大命等通过对微囊藻毒素合成基因家族成员mcyD和16SrDNA序列进行荧光定量PCR,分析了太湖和巢湖水华期间产毒微囊藻和非产毒微囊藻种群丰度的空间分布.BoonN等使用荧光定量PCR等分子定量的方法分析了活性污泥受到3-氯苯胺压力条件下氨氧化细菌群落丰度和结构的变化情况.HuangY等应用荧光定量PCR方法测定了在最优氧供应的情况下单级自养脱氮反应中各种氮循环相关微生物的数量.MatsukiT等针对人体肠道双歧杆菌的16SrDNA设计了特异性引物,并通过荧光定量PCR方法进行了定量研究.张晶等也阐述了荧光定量PCR方法在环境微生物、微生物生理代谢、微生物群落分布等领域的广泛应用及前景.因此,该方法在分析窖龄、维护窖池以及提高人工老窖的技术方法上也有着很大的潜力和意义,然而目前在窖泥微生物研究中的应用还非常少.本文研究采用荧光定量PCR技术,分析了两个酒厂不同窖龄窖池中真细菌、古细菌和6种主要菌属的含量,旨在为探索窖龄与窖池微生物的对应关系奠定基础.1材料和方法1.1要选取样品,在半t四川剑南春酒厂(A酒厂)酿酒车间5、10、20、30、50年窖龄窖池,下层窖泥.四川水井坊酒厂(B酒厂)酿酒车间1、20、50、150年窖龄窖池下层窖泥.每个年份随机选取两个窖池,在四角和中心3-5cm深度处各取一个样,混合均匀并真空密封后于-20℃冰箱冷冻保存.1.2dna试剂及pcr反应试剂基因组DNA快速抽提试剂盒(土壤)、T-载体PCR产物克隆试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、UNIQ-200柱式质粒DNA中量抽提试剂盒、PCR反应试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司;SYBRPremixDimerEraserTM荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司.荧光定量PCR仪为美国BIO-RAD公司产品.1.3ssr标记结合本课题前期微生物群落结构分析实验结果和文献,选取窖泥微生物中6个主要菌属的代表菌株,以其16SrDNA序列为模板,应用PrimerPremier5软件、oligo7软件及NCBIBlast对其设计属间特异性引物,评价引物;根据文献[17-18]所述优化确定真细菌及古细菌的通用性引物.每对引物扩增片段长度80-200bp.引物由华大基因科技有限公司合成.常规PCR对引物最适退火温度进行确定.引物信息见表1.1.4要去除要去除要去除要去除要去除要去除要去除目前土壤中总dna的活性取0.5g窖泥,使用基因组DNA快速抽提试剂盒(土壤)提取窖泥微生物总DNA,其中含腐殖酸去除剂可以去除大部分腐殖酸.电泳检测.1.5t-载体pcr产物测序用以上引物,以及各年份提取的总DNA为模板,PCR扩增,产物使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收,然后使用T-载体PCR产物克隆试剂盒进行连接转化.对转化后的阳性克隆子进行随机挑取4个样,培养后送交华大基因进行测序.将测序结果(片段大小100-200bp),于NCBIBLAST中比对.1.6荧光定量pcr检测质粒中量抽提率选取上一步骤中制得的测序结果与目标片段相似度最高且达到97%的克隆子,并用UNIQ-200柱式质粒DNA中量抽提试剂盒抽提得到的质粒,作为该目标菌进行荧光定量PCR的标准质粒.测量其260nm及280nm下的吸光度值,计算得到其拷贝数和纯度信息,见表2.选取合适的浓度范围对标准质粒进行10倍梯度稀释,得到标准质粒稀释梯度.1.7荧光定量pcr反应标准曲线以10倍梯度稀释的质粒作为模板,选择浓度合适的至少5个稀释梯度,每个稀释梯度3个平行样.以各年份窖泥总DNA作为待测样品模板,每个样2个平行,以目标菌属亲缘关系相近菌属的16SrDNA作为阴性对照模板(总真细菌PCR以古细菌代表株16SrDNA作为阴性对照,总古细菌PCR以真细菌代表株16SrDNA作为阴性对照);以ddH2O作为空白对照模板,进行荧光定量PCR.反应体系(20μL):SYBRPremixDimerEraserTM试剂盒qPCRPlus10μL,正向引物0.8μL,反向引物0.8μL,ddH2O6.4μL,模板2μL.反应条件:95℃30s;95℃5s,最适退火温度20s,72℃20s(采集荧光),45个循环;溶解曲线分析,55-95℃,每循环10s(采集荧光),每循环后升温0.5℃.2结果与分析2.1菌株的筛选结果检测的6对特异性引物,每对引物4个抽样比对后相似度最高菌株均相同,以Sporanaerobacter、Petrimonas、Tissierella、Methanobrevibacter、Methanoculleus、Methanosarcina为目标的引物对应的相似度最高的菌株NCBI登陆号分别为NR_025151.1、NR_042987.1、NR_044860.1、NR_028779.1、NR_042786.1、NR_074221.1,它们均属于预期目标菌属,测序结果与其相似度>97%,差异碱基<6bp.说明引物的特异性好,可以为后续使用.2.2不同产品品质分析通过BIO-RADIQ5软件分析所得结果,得到标准曲线和每个样品的数据结果.标准曲线相关度系数R2均在0.996以上,扩增效率在90%-105%范围内,阴性对照和空白对照CT值均大于30且远大于待测样CT值,熔解曲线呈现单一峰,无引物二聚体的明显扩增,数据具有可信度.视一个质粒拷贝对应一个菌,即由质粒拷贝数为标识的标曲得到窖泥中某种微生物的数量.对同酒厂同年份窖池2个窖泥样数据求平均,得到表3.2.3不同酒酒要素阶段不同酒空间真细菌数量和总真细菌数变化对上述所得平均数求对数,以此反映待测菌数随窖龄增加的变化情况,如图1.某一目标菌数对数曲线的纵坐标越大,其在窖泥中的含量越大,曲线波动幅度指示了该目标菌菌数随窖龄增加的变化情况.其中各菌属数量变化趋势与总真细菌数或总古细菌数变化趋势基本保持一致,总趋势是逐渐增多并趋于稳定.但A和B两个酒厂窖泥的同一种微生物数量差异较大.不同酒厂窖泥真细菌和古细菌数量比例也有所差别,A酒厂窖泥古细菌占优,B酒厂窖泥则真细菌数量较多.B酒厂150年与50年窖泥微生物数量接近.分别计算3种真细菌属数目占窖泥总真细菌数的百分比以及3种古细菌属数目占窖泥总古细菌数的百分比.所得百分比与窖龄关系见图2.其中A酒厂窖泥微生物中的Methanobrevibacter以及B酒厂窖泥微生物中的Methanosarcina占古细菌百分比与总的古细菌数量变化关系不大,而且与窖龄呈现较好的线性关系.3基于荧光定量pcr方法的b酒酒质分析使用窖池及窖泥发酵是中国浓香型固态白酒酿造的独特工艺,微生物的数量及相互的关系则对窖池的老熟和白酒品质都有着决定性影响.研究不同年份窖泥主要微生物的丰度,对揭示窖泥老熟机制、分析天然窖池窖龄有重要作用.本研究应用PrimerPremier5软件对6种目的菌属设计了特异性引物,并分别通过oligo7软件及NCBIBlast对其进行可行性和特异性评价,通过对引物进行PCR扩增并分析部分PCR产物序列对引物特异性进行抽样验证.建立了综合评估荧光定量PCR引物的方法.本研究利用荧光定量PCR方法测定了该6种目标菌在各年份窖泥中的含量,探索了微生物与窖泥老熟和年份的内在联系.由结果可知,随着窖池不断发酵产酒,微生物数量虽有波动变化,但总体趋势是增加,证实了正常窖池的窖泥微生物丰度与窖池所酿白酒酒质的正相关关系,与其他研究结果一致.根据B酒厂窖泥微生物数目的对数曲线,150年与50年窖泥几种微生物菌属数量接近.某些微生物所占总真细菌或古细菌百分比与窖龄呈现较好的线性关系,如A酒厂窖