山羊瘤胃微生物16srdna的提取

山羊瘤胃微生物16srdna的提取

肿瘤胃的环境适合微生物的栖息地和繁殖，有许多微生物。每个丝状肿瘤胃的内容物含有1010101个细菌。饲料中的养分在肿瘤酶中蒸发和分解，最终的养分转化为肿瘤胃壁细胞并进入血液循环。它们是反刍动物能量的主要来源。尽管这些瘤胃微生物在反刍动物的消化和营养中具有重要作用,但其中99%的微生物难以获得纯培养,也使其不能被充分的开发和利用。因此对提取微生物总DNA进行分子生物学分析的免培养法能够获取瘤胃微生物更加全面完整的信息,筛选和挖掘新的功能基因及生物活性物质,为瘤胃微生物的研究提供新的技术和手段。建立高效、可靠的微生物总DNA提取方法是进行微生物后续研究的基础,目前已成为国内外研究者关注的热点。瘤胃成分复杂,其中栖息着复杂多样的微生物,包括细菌、原虫、真菌和噬菌体等几大类。在提取的过程中含有较多的抑制成分,比如腐殖酸、酚类化合物等,因此从瘤胃中提取微生物的宏基因组有一定的难度,特别是样品的预处理及提取过程,一般耗费的时间比较长。如果提取的DNA中含有的较多的抑制成分、不纯化或者纯化效果不好,将影响后续的PCR、酶切等后续工作,因此不管是瘤胃宏基因组文库的构建还是瘤胃微生物的分子生物学研究,获得一种简单,快速,纯度高的DNA对后续研究尤为重要。1材料和方法1.1模型设计和合成1.1.1主要试剂λDNA/HindIIIMarker、DL2000Marker和TaqTM购于宝生物工程有限公司(大连);通用引物由宝生物(大连)有限公司合成,引物序列见表1。1.2方法1.2.1sds-pcr法山羊瘤胃内容物总DNA的提取方法参照ZHOU等和MURRAY等方法并做了改进,具体如下:称取5个山羊瘤胃内容物各10g并将它们混合,用PBS缓冲液稀释样品,搅拌机充分搅碎,经六层纱布过滤得瘤胃液。取10mL瘤胃液于50mL离心管,加10.0mL提取缓冲液(100mmol/LTris·HCl,pH8.0;100mmol/LEDTA;100mmol/L磷酸钠缓冲液,pH8.0;1.5mo1/LNaCl;1%CTAB;1%PVPP),充分混匀,加入溶菌酶(50mg/mL)使其终浓度达到1mg/mL,37℃,180r/min振荡0.5h;置液氮中冷冻5min,取出在65℃水浴中保温至完全融化,反复冻融共3次;加入20%SDS终浓度达到2%,混匀后60℃保温2h,每隔20min颠倒混匀;13000r/min离心10min,收集上清,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,轻柔混匀,13000r/min离心10min,收集上清,加入0.6倍体积的异丙醇,-20℃放置3h以上,13000r/min离心20min,弃去上清,沉淀用70%的乙醇清洗2～3次,自然干燥,加500μL无菌水溶解,-20℃冰箱保存备用。取10μLDNA电泳检测。1.2.2纯度检测和d测量用紫外分光光度计测定DNA在280、260和230nm下的A值,根据A260/A230、A260/A280计算出DNA的浓度。1.2.3瘤胃微生物总dna的pcr扩增从瘤胃微生物总DNA中扩增细菌的16SrDNA。引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,引物R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系为25μL:模板0.5μL,正向引物(25mol/L)l.0μL,反向引物(25mol/L)1.0μL,TaqMix22.5μL。反应条件:预变性95℃5min;变性94℃30s,54℃30s,72℃10min,30个循环:最后72℃延伸10min。从瘤胃微生物总DNA中扩增古细菌的16SrDNA。引物F为5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′,引物R为5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′,PCR反应体系和反应条件同上。2结果2.1总dna片段经琼脂糖凝胶电泳检测显示,提取的山羊瘤胃微生物总DNA条带较亮,但电泳胶孔中含有不明的大分子物质,并存在拖尾现象,获得的DNA片段大于23kb,属于大片段DNA。2.2定了显著性检验,即测定一个结论,结果如下经紫外分光光度计对提取的瘤胃微生物总DNA的纯度进行测定,结果见表2。瘤胃微生物总DNA的260/280的A值平均在1.260～1.464,260/230的A值平均在1.000～1.214,表明此方法提取的DNA纯度较高。2.3pcr扩增微生物总dna的电泳结果进一步利用细菌和古细菌16SrDNA通用引物对提取瘤胃微生物总DNA的质量进行检测。PCR扩增微生物总DNA的电泳结果见图2。通过PCR直接从粗提总DNA中扩增出长度分别为1500bp、1000bp左右的瘤胃细菌和古细菌的16SrDNA序列,而且获得的目的条带单一,没有杂带,说明提取的瘤胃微生物总DNA质量较好,可以直接用于PCR扩增。3关于瘤胃微生物的提取方法更容易为反刍动物(牛羊等)能够利用青粗饲料并将其转化成营养丰富的肉、奶等产品。这是因为瘤胃微生物即细菌、原虫和真菌等在饲料的消化过程中进行的厌氧发酵起了主要的作用。山羊对劣质粗饲料的利用率远高于其他家畜,因此,开展山羊瘤胃微生物的研究,对于调控瘤胃微生物的活动,增强反刍动物的消化功能,提高其生产性能及瘤胃微生物资源开发和利用都具有重要意义。但是瘤胃是一个特殊的厌氧环境,采用传统的微生物培养不但耗时耗力,而目99%的微生物难以获得纯培养。国内外研究者纷纷避开了传统培养而直接从瘤胃内容物中提取微生物DNA,利用免培养技术研究瘤胃微生物,如隋昶生等采用未培养技术优化崂山奶山羊瘤胃细菌总DNA提取方法。BEKELE等通过未培养技术分析瘤胃密螺旋体的系统发育多样性。通过分子生物学方法,直接提取样品中微生物总DNA进行分析的方法,在一定程度上克服了传统方法的弊端,避开了纯培养的步骤。提取到高质量的瘤胃微生物总DNA是采用免培养技术研究瘤胃微生物的基础。吕莉华等探讨了绵羊瘤胃微生物基因组DNA提取方法,获得了高质量的微生物基因组DNA。王远亮等采用未培养技术直接从荷斯坦奶牛瘤胃液中提取瘤胃细菌微生物混合DNA,对瘤胃细菌多样性进行了初步分析研究。在山羊瘤胃微生物的研究中,作者所采用的DNA提取法获得了足够大的DNA片段,进一