五种瘤胃微生物基因组dna提取方法比较

五种瘤胃微生物基因组dna提取方法比较

肿瘤微生态是一种复杂的生态系统，由大量的古细菌、真菌、真菌和原生动物组成。这一系统是世界上纤维原生动物转化使用最有效的自然系统之一。瘤胃微生物的生长代谢活动能够为宿主动物提供能量,蛋白质,氨基酸和维生素等营养物质,是研究反刍动物营养代谢的关键。但是由于瘤胃微生物数量巨大,种类繁多,且绝大多数是严格厌氧或兼性厌氧,体外培养困难,再加上大量不可培养微生物的存在,采用传统培养技术已经很难对瘤胃微生物进行更加全面而深入的认识。近年来,随着现代分子生物学的发展,为瘤胃微生物的研究提供了新的技术和手段,特别是微生物rDNA分子生物技术为瘤胃微生物的评价开辟了新的途径。能提取出环境微生物中的总DNA就可以对复杂的微生物系统进行大量系统的研究,还可以用于检测不可培养的微生物,跟踪某些目标菌株在自然环境中的行为,也可用来揭示微环境中基因多样性及其随环境变化的特征。目前国内外对环境微生物样品如土壤,海洋,淤泥,垃圾等进行rDNA序列和分析序列系统发展及多样性研究已有大量报道,其中不乏有关通过免培养技术对瘤胃微生态的研究报道,如ChristopherMcSweeney,RoderickMackie,王远亮等,提出了多种提取瘤胃微生物DNA的方法,但是将这些方法进行系统比较的研究较少,而获得有代表性的瘤胃微生物DNA将有助于研究瘤胃中微生物区系随环境的动态变化及其多样性,本试验以此为出发点摸索瘤胃微生物基因组DNA的提取方法,为后续分子生物学研究提供质量和纯度较高的样本DNA。1材料和方法1.1材料表面瘤胃内容物来自于安装有永久性瘤胃瘘管的蒙古绵羊。1.2样品的预处理参见文献中样品处理方法。1.3提取的dna1.3.1菌体沉淀液的制备取100μL1.3中处理过的样品,用9倍体积生理盐水洗涤2次,获得菌体沉淀。以下各方法所用菌液均来自于同一样本,取样量均为100μL。1.3.2提取各组dna选取国内外常用的五种提取微生物基因组DNA方法,分别提取1.3.1中收集的菌体沉淀中微生物DNA。(1)水煮法参照文献中DNA提取方法,略做改进,加入溶菌酶37℃消化1h。(2)溶解酶sds-苯酚或氯仿法参照文献中DNA提取方法。(3)经典苯酚法参照文献中DNA提取方法。(4)氯化氯仿法照文献中DNA提取方法。(5)饱和酚/氯-异戊醇的制备参照文献中DNA提取方法,经修改后具体步骤如下:菌体沉淀中加500μL分离缓冲液(100mmol/LTris-HClpH8.0,50mmol/LEDTA,0.1%SDS,200μg/mL蛋白酶K),使菌体充分悬浮,加入0.5g玻璃微珠(TIANGEN公司,200-400目),漩涡振荡器上震荡3min,再加入10μLβ-巯基已醇,1%(g/V)PVP(聚乙烯基吡咯烷酮),50℃消化1h,期间不断混匀;加入65μL10%(g/V)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵),120μLNaCl,混匀,55~65℃水浴3h或过夜消化;用等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇,氯仿/异戊醇各抽提1次,取上清液加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/LNaAC,冰上放置15min,12000r/min,4℃,离心10min;70%乙醇洗涤2次,晾干,加入100μL1×TE,加入适量Rnase,37℃处理30min,4℃备用。1.4含量、纯度和电泳试验用紫外可见分光光度计(Eppendorf)测定各DNA浓度和纯度,0.8%琼脂糖凝胶电泳DNA,拍照观察。1.5粗提dna的纯化采用TIANGEN公司的DNA产物纯化试剂盒对1.3中5种方法粗提的DNA进行纯化,DNA纯化后溶于分别100μL无菌ddH2O,供DNA含量和纯度的测定以及作PCR扩增的模板。1.6对dna质量的检测1.6.1pcr检测驱动下的3dna片段通过1.4中对各方法提取的DNA含量、纯度和电泳检测结果,选取其中较优的方法,以此方法提取的DNA为模板,纯化后扩增瘤胃古细菌,真细菌和真菌16/18SrDNA片断,以检测DNA的质量和完整性。各个体系设3个重复,所用引物序列见表1。其中真细菌的引物为FP27,EUB338。PCR反应体系(20μL):2×premixExTaq预混液10μL,10μmol/L的引物各0.8μL,模板(瘤胃微生物总DNA)5μL,ddH2O3.4μL。PCR反应参数:94℃变性4min;95℃40s,51~61℃1min,72℃1.5min;共35个循环;72℃7min。1.6.2srdna片段的pcr扩增纤维降解菌为瘤胃降解粗纤维的主要功能菌,以1.4中筛选出的较优方法提取的DNA为模板,扩增3种主要的纤维降解菌Fibrobactersuccinogenes、Ruminococcusflavefaciens、Ruminococcusalbus的16SrDNA片断,以进一步检测该DNA的全面性。各个体系设3个重复,PCR反应体系、和参数同1.6.1,扩增产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测观察,拍照。所用引物序列见表2。2结果与分析2.1种方法所提取dna的纯度和纯度反刍动物瘤胃内容物成分复杂,含有庞大的微生物种群,以及饲料残渣,动物消化道脱落细胞和许多不明生物物质,使粗提得到的DNA含有非常多的杂质。由于瘤胃液中色素、酚与多糖含量高,本身呈黄色,粗提的DNA也略带黄色。图1为5种方法粗提DNA电泳结果,其中溶菌酶-水煮法条带不清楚,且亮度不够,说明这种方法很难裂解复杂的瘤胃微生物细胞,不适合用来提取瘤胃微生物总DNA。而溶菌酶-SDS-酚/氯仿法、经典酚/氯仿法、氯化苄法和珠磨-SDS/CTAB/PVP法均有条带出现,片段长度在20kb以上,但电泳胶孔中含有多糖和大分子不明物质,并且有拖尾现象。表3所示为用紫外可见分光光度计测定各DNA浓度和纯度,进一步检测1.4中5种方法粗提DNA的含量与纯度。由表中结果可以看出5种方法所提取的瘤胃微生物DNA纯度和含量均有显著差异,其中改进后得珠磨-SDS/CTAB法提取DNA的纯度和含量均居5种方法之首。图2是将图1中出现条带的粗提DNA进行纯化的结果,可见溶菌酶-SDS-酚/氯仿法粗提的DNA经纯化后条代亮度明显降低,而珠磨-SDS/CTAB/PVP法,氯化苄法,经典酚/氯仿法各个泳道的DNA条带集中、清晰,胶孔都很干净。经过纯化后的DNA沉淀颜色较白,说明色素等有色杂质被去除。用紫外可见分光光度计测得OD260/OD280达到1.8以上。较纯化前条带亮度均略有下降,原因可能是粗提DNA中含有许多DNA小片段或残留RNA片断,在纯化过程中被除去;另外纯化试剂盒回收效率无法达到100%(试剂盒中说明回收效率在80%以上)。综合以上5种方法,珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取得到的DNA样本纯度以及得率都居5种方法之首,优于其他4种方法,所以本试验初步确定珠磨-SDS/CTAB/PVP法为提取绵羊瘤胃微生物基因组DNA最优方法,为了证明这种方法的适用性,又对此DNA质量进行了分子生物学手段检测。2.2菌株鉴定及pcr扩增结果图3为以珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取的DNA为模板,扩增绵羊瘤胃古细菌,真细菌和真菌16/18SrDNA片断。由图可见以珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取获得的DNA为模板分别扩增瘤胃古细菌、真细菌和真菌都能获得较理想的结果,真细菌预计所扩增片段为331bp,其PCR扩增结果在300~400bp之间出现条带;古细菌预计所扩增片段为910bp,其PCR扩增结果在900~1000bp之间出现条带;真菌预计所扩增片段为785bp,其PCR扩增结果在700~800bp之间出现条带。以上3种菌的扩增结果都与原目标片段相符,且扩增结果稳定,重现性较好。图4为珠磨-SDS/CTAB/PVP法提取的DNA为模板,扩增瘤胃3种纤维降解菌的16SrDNA,Fibrobactersuccinogenes预计所扩增片段为446bp,其PCR扩增结果在400~500bp之间出现条带;Ruminococcusflavefaciens预计所扩增片段为173bp,其PCR扩增结果在100~200bp之间出现条带;Ruminococcusalbus预计所扩增片段为178bp,其PCR扩增结果在100~200bp之间出现条带以上3种菌的扩增结果都与原目标片段相符,且扩增结果稳定,重现性较好。以上分子生物学手段检测结果说明利用珠磨-SDS/CTAB/PVP法可以得到瘤胃微生态中绝大部分微生物的基因组DNA。粗DNA纯化后,可以满足PCR分子生物学操作的要求。3pcr扩增的效果分析由于瘤胃内环境及其中微生物的复杂性,目前还缺少选择性培养基,常规传统分析微生物的方法受到了极大的限制。鉴于此原因国内外研究者都纷纷避开了传统培养而直接从瘤胃内容物中提取微生物DNA,利用免培养技术研究瘤胃微生态,如王远亮采用未培养技术对荷斯坦奶牛瘤胃细菌多样性进行初步研究;TajimaK通过16SrDNA序列分析瘤胃细菌区系等。本研究选取了5个实验室常用提取微生物DNA的方法进行了比较,并对其中有的方法做了一定改进,得出珠磨-SDS/CTAB/PVP法所提取得到的DNA在纯度和浓度上都优于其它几种方法,粗提DNA产量达(851.78±9.86)μg/mL,OD260/OD280在1.7左右;PCR扩增古细菌、真细菌和真菌16/18SrDNA片断均得到了预期的效果,扩增结果稳定,重现性较好;限制性内切酶分析也得到了较为理想的效果。分析其原因可能在于对细胞裂解的差异,在提取DNA过程中,细胞裂解是非常重要的环节,因细胞结构及所含成分不同,样品细胞裂解也有所不同。SDS法一般适用于血液,细胞,动物组织,细菌,酵母等;CTAB法和氯化苄适用于植物组织,真菌等;此外还有物理方式,化学方式和酶法,主要针对一些细胞壁结构复杂,难于裂解的样品。反刍动物瘤胃内容物微生物种群含有大量革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,真菌及其游动孢子等微生物,使得细胞破壁显得更加关键。本研究得出采用珠磨-SDS/CTAB法提取获得的瘤胃微生物总DNA结果较好,该方法鉴于有些瘤胃微生物细胞壁结构特殊且较难裂解,以玻璃珠机械破壁为主,使用CTAB与SDS相结合来裂解消化细胞,兼顾大多数瘤胃微生物特性,混合DNA中包含了各种古细菌、真细菌和真菌的基因组DNA。另外裂解过程中加入了β-巯基乙醇和PVP(聚乙烯基吡咯烷酮)来排除酚等次生干扰物质,缓解褐色沉淀。一般而言来自环境中的样品含有非常复杂的成分,瘤胃微生物样品中也存在同样问题。粗提DNA中大量杂质直接影响后续的分子生物学操作,如PCR,核酸杂交,内切酶消化等,所以瘤胃微生物中提取的DNA样品也需要进行纯化。本