胶原模拟多肽三螺旋结构的研究

胶原模拟多肽三螺旋结构的研究

特定序列设计天然胶的原因具有良好的生物适应性和可分解性，因此在生物材料领域进行了广泛的研究和应用，如组织结构、可吸收调整等。胶原具有独特的三螺旋结构,这与胶原的稳定性及与细胞识别等多种生物学活性密切相关。但胶原结构复杂、功能域众多、分子量大且较难制成溶液,这一定程度上限制了对胶原的进一步研究。胶原模拟多肽(collagenmimeticpeptide,CMP)是指一类依据胶原一级结构的特定序列设计,可模拟天然胶原部分特征结构、生物学活性的多肽,也可作为一种分子模型,用于研究胶原特征结构及胶原特定序列的功能。研究较多的一类是Pro-Hyp-Gly(POG)重复片段,这类多肽可形成类似天然胶原的三螺旋结构,另一类是胶原与整合素的作用片段Gly-PheHyp-Gly-Glu-Arg(GFOGER),相关研究显示整合素能够识别胶原肽链的某一片段,但这种识别作用依赖于胶原三螺旋构象的存在。圆二色谱(circulardichroism,CD)是用于测定具有手性结构、能产生左右旋光差异性吸收的化合物结构,主要用于测定分子结构不对称性的光谱学方法。一般生物大分子中均含有手性的基团和结构,因而CD常用来测量和观察生物大分子的结构和构象的变化。胶原和CMP三螺旋结构的CD特征一般是在225nm附近有一个正吸收峰,在197nm附近有一个负吸收峰,吸收峰的位置随着氨基酸序列和长度的变化会发生偏移。因此,CD谱可用来研究胶原和CMP三螺旋结构及其热变性过程。根据胶原特征重复序列(POG)n及胶原上α2β1整合素识别位点GFOGER设计不同序列或长度的CMP,通过CD谱研究其三螺旋结构、热稳定性等随序列或长度的改变所发生的规律性变化,为进一步研究胶原与CMP分子特征性的三螺旋结构形成规律及其用作生物材料奠定基础。1实验部分1.1多肽的合成及hplc扩增圆二色谱仪:J-815(日本JASCO公司)。胶原模拟多肽长度与序列见表1,其中GFOGER为Ⅰ型胶原的整合素识别序列(bindingsequence,BS)。所有多肽均为作者设计,上海吉尔公司代为合成,HPLC检测纯度>90%。所有水溶液均用MilliQ-biocel系统过滤后配制。1.2cmp的初始稳定性配制0.3mg·mL-1的五种CMP水溶液,于4℃静置平衡48h;分别将其注入厚度为1mm的石英样品池,用圆二色谱仪常温下进行样品的CD测试。各参数设置如下:扫描波长范围190～260nm,带宽1nm,分辨率0.1nm,扫描速度100nm·min-1,累计扫描3次。将CD值换算成氨基酸残基平均摩尔椭圆度(meanresidueellipticity,MRE,[θ])来表示CMP的圆二光谱吸收值。其中,θ为椭圆率(mdeg),1为石英池厚度(mm),c为CMP溶液浓度(mg·mL-1),M为CMP分子摩尔质量(g·mol-1),nr为CMP中氨基酸个数。1.3变性温度测试配制0.3mg·mL-1的五种CMP水溶液,于4℃静置平衡48h;分别将其注入厚度为1mm的石英样品池,用CD仪进行变温扫描。温度范围10～70℃,升温速度20℃·h-1,每5℃扫描一次共测试13个温度点,扫描波长范围190～260nm,扫描前每个温度点平衡15min,其他参数参考室温CD测试。由CD值计算[θ]值,并根据λ=225nm处的[θ]值作图,可确定CMP的变性温度(Tm)。五种CMP溶液测试完变性图谱后,在70℃平衡30min使其充分变性。参照升温过程的CD测试方法,进行降温复性测试。同样计算λ=225nm处的[θ]值作图,得复性圆二色谱图。2结果与讨论2.1最大吸收峰的确定五种CMP溶液室温CD谱图及相关信息如图1、表2所示。每种CMP在波长190～260nm范围内均有正负吸收峰,最大正、负吸收峰(MRE极值点)分别处在222～225nm和197～200nm范围内,吸收值与X轴的交叉点(MRE≈0处)均在在218nm附近。表明设计合成的五种CMP室温下均可自组装形成有类似于胶原的特征性三螺旋结构。2.2温度突变时cmp的热变性CMP的热稳定性一般用解链温度TM来衡量。Tm值越大,三螺旋结构越难解旋成α单链,说明CMP的热稳定性越好;相反,Tm仇越小,三螺旋结构越易解旋为α单链,则CMP热稳定性越差。Tm值一般可由CD热变性曲线突变区间计算获得,其值与样品浓度和加热时间有关,所以在相同条件下测试比较才有意义,但许多研究者往往忽略了浓度的影响,本实验每个样品的浓度和实验条件均一致。图2为五种不同CMP圆二色谱曲线随温度升高的变化趋势图(10～70℃,每隔5℃作一条曲线)。可以看出,随着温度的升高其正、负吸收峰均逐渐变小,正负吸收峰绝对值之差逐渐变小,且每种CMP在特定的温度附近都有一个吸收峰仇的突变。图3为五种CMP在λ=225nm处的热变性、复性曲线图,由图3(a)可以看出:随温度的升高CMP的圆二色吸收值逐渐减小,在特定温度范围内有明显一个的突变,之后吸收值变化趋于平稳。由温度突变区间可计算得每种CMP的解链温度Tm(见表1),在微观上,温度到达Tm值之前,CMP一直以三螺旋结构形式存在,所以吸收值在此温度范围内基本保持不变。当温度快到达Tm值时,三螺旋的α单链间开始解旋,吸收值迅速变小。当温度温度大于Tm值之后,CMP彻底解旋,α链以无序卷曲单体的形式存在存在。其吸收值变化趋于平稳。从表1中三种CMP的Tm可看出随特征序列(POG)个数的增加解链温度明显升高。含识别序列的(CMP30-BS解链温度远低于只由重复序列组成的CMP30,可见其同一个分子内的三条α链间结合力较弱,这是因其中间的GFOGER序列不能参与三螺旋结构的形成所致,使得CMP30-BS的α链不同于CMP30等只含特征序列(POG)的α链,所氨基酸都参与螺旋结构的形成。由复性CD图3(b)可见,其降温过程中吸收值逐渐增加,CMP又由无规则的卷曲单体逐渐结合重新形成三螺旋结构,但无明显温度突变过程,这可能与其动力学过程相关。由之前实验可知:当T处于室温或是Tm值以下时,CMP均以三螺旋结构形式存在,T>Tm时CMP解聚为无规则的卷曲单体(即变性),当温度再次降到Tm以下时CMP恢复其三螺旋结构(即复性),所以CMP的热变性过程是可逆的。这与天然胶原加热变性后三螺旋结构被彻底破坏的不可逆过程是不同的。胶原圆二色谱图中的正负吸收峰强度比的绝对值(theratioofpositivetonegative,RPN),一般用来表示胶原溶液中三螺旋结构的螺旋程度,认为RPN值可以值可以反映CMP三条α链间螺旋程度的高低。图4为CMP的RPN值随温度变化曲线,随温度升高CMP的RPN值变化趋势与其吸收值相同,RPN值变化曲线上也有一个与吸收值的突变区间基本一致的温度突变区间。说明CMP溶液中α链间的螺旋程度在Tm值前基本保持稳定,到达Tm值时螺旋程度急剧下降;形成螺旋结构的α链间逐渐解体开始变为无规则的卷曲单体,当T>Tm之后RPN值基本不再发生改变,说明螺旋程度不再变化,α链以单体形式存在。这与CD热变性曲线的趋势一致。2.3复性过程的mre值比选前面提到,变性过程和复性过程是不同的,将一种CMP的变性与复性曲线图对比线图对比可见明显的“磁滞”现象。有文献中指出这是由于复性过程中产生了不稳定的中间体或是由无数平衡常数有少许差异的微复性过程组成,从而导致相同温度下复性过程的MRE值要小于变性过程。就实验结果观察我们认为此现象出现的原因可能是:变性之前CMP是经过很长时间(>24h)的平衡过程,溶液体系达到了最稳定的结构。即使平衡开始时不是最稳定结合的α链也会慢慢全部转化为最稳定的三螺旋结构存在。可见变性过程是体系中最稳定的三螺旋结构解旋变为无序卷曲单体的过程,此过程中MRE值较大。但是复性过程时间较短,α单链间相互形成的三螺旋结构不是溶液体系中最稳定的,而是能发生反应的基团间快速的化学键形成过程。所以其螺旋程度不及相同温度时的热变性过程,MRE值也就偏低。这在CD曲线上就表现为“磁滞”现象(图5)。我们的后续研究中将进一步探讨此现象产生的机制。3不同温度对三维螺旋结构的影响通过圆二色谱研究了设计合成的五种CMP的三螺旋结构及其热稳定性:室温下,CMP在溶液中均以三螺旋结构的形式存在;CMP三螺旋结构的热稳定性(Tm值)随着特征序列(POG)三联体个数的增加而增强。天然胶原的热变性过程是不可逆的,温度高于其变性温