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文档简介
大肠杆菌表达系统研究进展
到目前为止,已经研究了多个原始核和真实核的生产系统。与其它系统相比,大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、可以大规模发酵培养的优点,是现阶段最常用的表达系统。但在外源基因表达过程中,还可能存在着表达效率不高、活性不够等问题。笔者从表达量、表达活性、实验步骤的简化和成本控制4个方面综述大肠杆菌表达系统及其最新的研究进展,为人们了解大肠杆菌系统的表达机理,更好的选择适合目的蛋白表达的大肠杆菌系统提供参考。1表达变量1.1对稀土元素的监督在蛋白质翻译过程中,tRNA携带相应的氨基酸与核糖体上的A位作用,如果上到A位的tRNA与该密码子相对应,就可进行肽链的合成与延伸。原核生物中,由于不同tRNA含量上的差异产生了对密码子偏爱性。tRNA丰富的密码子,正确的氨基酸会很快连接上。而tRNA稀少的密码子,要经过多次相互辨认才能找到正确的tRNA,外源蛋白的合成将因此停顿,如果相同的稀有密码子连续出现,会抑制蛋白质合成,发生密码子错配。统计E.coli中密码子使用情况发现:AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC8种密码子是大肠杆菌的稀有密码子。含有较高比例的稀有密码子的外源基因,表达效率往往不高,应针对密码子的偏爱性采取措施,如采用非连续多核苷酸定点突变方法对cDNA中稀有密码子进行同义突变,或提高某种氨基酸的tRNA浓度。Novagen公司的RosettaTM大肠杆菌菌株就可以提高多种稀有密码子的tRNA量。同时,SrinivasanG等报道Methanosarcinabarkeri甲胺转甲基酶基因中UAG密码子编码了一个赖氨酸衍生物。因此,在重组蛋白表达中应避免使用UAG作终止密码子,防止转录过程的通读。1.2蛋白表达系统增强子是基因表达的重要调节元件,目前在病毒、植物、动物和人类正常细胞里都发现有增强子存在。在原核细胞中也发现类增强子序列。增强子在一定程度上可以提高大肠杆菌表达系统的表达效率。Ω序列是烟草花叶病毒(TMV)的5′端非翻译区的一段68bp序列。Ω序列已广泛应用于构建植物表达载体,增强外源基因在植物中的表达。罗文新等用Ω序列对pET24(+)载体的转录调控区进行改造,以T7启动子和Ω序列为调控元件构建了两种E.coli融合蛋白表达载体,并通过增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达检测其表达效率,与同时构建的不含Ω序列的pET24(+)载体的表达产量进行比较研究。结果表明Ω序列能显著提高pET24(+)载体的表达效率。1.3提升外源基因表达外源基因转录出的mRNA一级与二级结构与外源蛋白的合成有很大关系,也是影响表达效率的重要因素之一。mRNA一级结构对翻译效率的影响已有较多研究。转录出的mRNA5′上游的SD序列与ATG之间的碱基数目和碱基组成对目的基因的翻译效率也很重要。一般认为,间距以6~11个碱基为最好,而碱基组成以C+G比例不超过50%为好。影响外源基因在大肠杆菌中表达的另一个因素是翻译起始区(TIR)的二级结构,TIR指一切与翻译起始有关的顺式序列,包括RBS及其它参与二级结构形成并影响翻译的序列。降低TIR二级结构稳定性可以提高翻译起始效率,提高mRNA稳定性,有利于外源基因表达。沈芸等报道通过改变原有载体的TIR区域的序列,成功开发出一个高效表达载体。1.4蛋白酶缺陷型大肠杆菌表达的重组蛋白可能会被大肠杆菌中的蛋白酶降解,Invitrogen等公司都已开发出蛋白酶缺陷型菌株,使用蛋白酶缺陷型菌株可以减少外源蛋白被降解的可能,从而提高一些重组蛋白的表达水平。2对蛋白的作用对于蛋白质工程来说,不仅要获得高产量重组蛋白,更重要的是保证蛋白的生物学活性,即可溶性和功能性———带有必需的磷酸基团、正确的二硫键与四级结构的完整蛋白。2.1复性再折合技术在E.coli中表达的异源蛋白往往以不溶的包涵体形式存在,需经一系列的变性复性过程才能得到可溶的活性蛋白。由于复性再折叠方法复杂,成本较高,近年来在E.coli中直接表达正确折叠的异源蛋白技术已成为一个研究热点。为得到有活性的蛋白分子,可采用如下方法。2.1.1分子学习中的dna也具有未编码肽分子伴侣是一类分布很广泛的蛋白质,其功能是介导其他蛋白质的折叠装配。分子伴侣能阻止多肽链之间因正电疏水区短暂暴露而发生的不正确作用,防止错误的装配。在E.coli细胞中,存在三种具有广泛特异性的伴侣复合物:一是由60kD的GroEL与10kD的GroES两种热休克蛋白(Hsp)组成的GroES/EL;二是由DnaK(Hsp70)与DnaJ、GrpE组成的伴侣复合物,新生肽链通过与DnaJ作用被DnaK识别,再与GrpE结合;第三种伴侣复合物是Clp系统(ClpA与ClpX),它的作用可能是识别易被降解的未折叠肽。对于表达的重组蛋白来说,只有分子伴侣与易于发生聚集的折叠中间产物发生有效的作用,才能对生成天然蛋白有积极的影响。目前,除GroES/EL与DnaK/DnaJ外,对于其他分子伴侣共表达的作用结果知之甚少。在蛋白质合成期,新生肽链先与DnaK/DnaJ/GrpE作用,然后与GroES/EL结合,有理由认为对分子伴侣作用机制中各组分的精确调节将是天然蛋白表达的关键。伴侣的共表达对于有些蛋白的表达是必需的。需要引起注意的是,伴侣的过表达可导致细胞丝状化或产生其他不利于生存和蛋白表达的表型。因此,必须将伴侣表达所造成的负效应降至最低,寻求最适的伴侣表达水平。共表达通常有两种方法,一种是采用双顺反子或多顺反子系统,将不同基因连同各自的SD序列串联在一起,克隆在同一启动子下游;或将不同亚基的表达单元,包括各自的启动子、SD序列和结构基因串联起来。为了防止转录过程中的通读,一般在最后一个基因的3′端加上较强的转录终止子。另一种方法是将不同基因克隆到两个相容表达载体中,通过共转化实现不同亚基在同一宿主中的共表达。当前,已经有很多成功的共表达系统被开发出来,如Novagen公司的Duet共表达系统就可以共表达多达8个目的蛋白。2.1.2膜蛋白sdbc活性折叠酶是指那些催化蛋白质特定异构反应的酶。这些异构反应是某些蛋白质折叠的限速步骤。大量表达(overexpression)这些折叠酶可以促进重组蛋白在大肠杆菌中的正确折叠。大肠杆菌中研究最多的折叠酶有催化二硫键形成的二硫键异构酶DsbA(DisulfateBindingProteinA),其功能依赖于膜蛋白DsbB。未折叠的新生肽链如先被氧化,极易形成不正确的二硫键,DsbC具氧化活性,其主要功能是催化不正确二硫键的重排与异构,使不正确二硫键易于打开,以形成天然构象。DsbC的功能由膜蛋白DsbD调节。除此以外,还有催化脯氨酸异构反应的蛋白质脯氨酸顺反异构酶(peptidyl-propyl-cis-transisomerase,PPI)。2.1.3还原酶基因制备在通常情况下,大肠杆菌细胞质内呈还原环境,不能形成二硫键,进而影响重组蛋白质构象的形成,在空间结构上形成错误的折叠,导致包涵体的形成。硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌由于缺失了硫氧还蛋白还原酶基因,其细胞质内的氧化还原态势发生了变化,由通常的还原环境转变为氧化环境,使表达的重组蛋白能在细胞质内形成二硫键,有利于重组蛋白折叠成正确构象,以可溶性蛋白质形式表达,这对于制备有生物活性的重组蛋白质具有重要意义。也有报道指出拥有trxB和谷胱甘肽还原酶(gor)突变的菌株比单有trxB突变的菌株更能促进二硫键的形成。Novagen公司已有这种带有双突变的菌株。2.1.4减少内涵体形成许多研究发现,采用很强的启动子如PL、T7等,重组蛋白虽可获得高效转录,但往往会聚集在胞内或结合在内膜内侧形成包涵体,而采用中等强度的启动子如lac、tac等则可以减少包涵体的形成。2.1.5融合蛋白的氨基酸活性除了直接表达重组蛋白,也可以将重组蛋白与某些溶解性好,易于纯化的蛋白融合在一起。融合表达往往可以获得外源基因的高效表达,减少蛋白酶的降解,并提供特异、简单的一步纯化方法。通过人工设计的蛋白酶切割位点或化学试剂断裂位点,可以在体外去除融合蛋白而获得有生物活性的重组蛋白。目前较为广泛采用的融合蛋白有谷胱甘肽转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、金黄色葡萄球菌蛋白A等。特别值得一提的是TrxA融合表达系统,因为它不仅可以高效表达可溶蛋白,而且硫氧还蛋白本身的热稳定性和通过渗透压处理很容易从E.coli胞质释放到胞外的性质,可为后续的蛋白纯化提供方便。纯化的融合蛋白切割后就可得到活性蛋白。也有报道指出它的融合蛋白不需切割就有生物学活性。Genetics、Invitrogen等公司都有这种产品。NewEnglandBioLabs公司的IMPACTTM-CN和IMPACTTM-TWIN表达系统也很有特色,因为他们的融合蛋白通过IPTG诱导或pH诱导就可以去除,而无需使用昂贵的蛋白酶。2.2胞外分泌对重组蛋白的诱导鉴于外源基因在大肠杆菌胞内表达时易于形成包涵体,而且胞内的折叠组装能力非常有限,采用分泌途径将重组蛋白分泌到周质空间或胞外不失为一个好办法。外源蛋白在细菌周质中的成功分泌需要在N端融合一段细菌蛋白的疏水性信号肽。融合蛋白跨内膜后由细菌的信号肽酶将信号肽切除,因而周质分泌可获得具有天然一级结构(不含N端多余的甲硫氨酸)的产物。同时,氧化性的周质间隙可以模拟真核细胞的内质网环境,便于新生肽链折叠成天然结构,从而获得具有完全生物学活性的重组蛋白。此外,周质间隙中蛋白水解酶与胞内相比少得多,可使产物不易被降解,因而周质分泌还可提高重组蛋白的稳定性。但是,周质空间小,重组蛋白表达量大还是会形成包涵体。周质空间的折叠效率有限,有时还会发生二硫键的错配。相比较之下,胞外培养基可能是重组蛋白最佳的去处。重组蛋白分泌到胞外不仅可以形成包括链间二硫键在内的正确折叠的空间结构,而且由于胞外的容量非常巨大,可以避免许多积累在胞内的问题(如聚集、包涵体形成等)。胞外分泌还可使重组蛋白的下游纯化更为简单,便于其规模的放大处理。目前已经研究出几个使外源蛋白分泌到培养基中的系统。大肠杆菌素释放蛋白系统:大肠杆菌素释放基因(Kil)表达时会引起大肠杆菌外膜通透性明显增加,并能促进周质蛋白质直接分泌到培养基中。童芹等成功构建了Kil蛋白介导的大肠杆菌外泌表达系统。α溶血素系统:α溶血素系统则是利用α溶血素能直接从胞内转运到胞外的特点,将外源基因融合到α溶血素的N端,从而使重组蛋白分泌到培养基中。这一系统的独特之处在于重组蛋白能直接从胞内转运到胞外,而不需要周质这一中间状态。郭斯若等还报道了一种L-型细菌蛋白表达系统。L-型细菌由于缺乏细胞壁,通过连接合适的信号肽,可以用于许多外源蛋白的可溶性、功能活性形式的分泌表达,直接把表达产物分泌到培养基中。3pqe-trafterisystem表达系统现代生物学实验中,人们不断开发出新的表达系统,简化实验步骤,争取时间。Invitrogen公司的Gateway表达系统在一系列的表达载体中设置了特殊的重组专一性位点,只需一次性地把目的基因插入Entry-vector,就可以利用载体上的特殊位点很方便的让目的基因在多种表达载体间转移。QIAGEN公司的PQE-TriSystem表达系统则在一个表达载体上构建了CAG、T5、p10三种启动子,表达载体一次性构建好后就可同时在大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫杆状病毒表达系统中表达。还有的表达载体在终止子位置排列了三个阅读框不同的终止子,使目的基因的插入不用再考虑转录终止的阅读框架问题,方便了表达载体的构建。现在的表达载体还普遍融合了纯化标签,真正实现一步分离纯化。目前常用的纯化标签有GST·Tag、His·Tag、Nus·Tag、HSV·Tag、S·Tag和CBD·Tag。其中GST·Tag、His·Tag、S·Tag可用相应的树脂及缓冲液试剂盒进行亲和纯化。使用GST·Tag和S·Tag可以对粗提物中的融合蛋白或纯化的蛋白进行精确定量测定。而CBD·Tag尤其适用重新折叠操作,因为只有正确折叠的CBDs方能与纤维素基质结合,而且CBD·Tag因纤维素基质本身极低的非特异性结合和生物兼容性特别值得推荐。标签技术的应用,为生产高纯度高活性的基因工程产品创造了有利条件。4大肠杆菌表达系统研究大肠杆菌外源基因表达系统是基因工程疫苗、药物、动植物生长因子和工具酶等生物技术产品研究开发的关键技术。这些产品最终都可能要进行工业化生产。而在工业化生产中,就不得不考虑成本控制问题。很多表达系统要使用IPTG等化学药品进行诱导表达,制造成本高,不利于大规模生产。人们已经研究出许多表达系统,比如:营养调控型、糖原调控型、pH调控型、溶氧调控型、生物素调控型的表达系统等。这些表达系统通过对菌体发酵和代谢过程条件的控制,实现对目标蛋白表达的
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