细胞生物学实验手册

细胞生物学实验手册

第四版前言这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制临床专业和研究生班。细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。全书内容共23个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。教材初稿曾于1989年《全国医学细胞生物学实验课培训班》试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。现在第四版在1993年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。目录前言实验室规则………………(1)常用实验动物了解和解剖器械的使用…………………(2)细胞生物学实验绘图方法与要求………（4）实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量…………………（5）实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察……（8）实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察……（10）实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察……(11)实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察……（13）实验六细胞生理活动的观察……………………（16）实验七细胞组分的化学反应……………………（20）实验八细胞核与线粒体的分级分离……………（23）实验九细胞分裂的形态观察……………………（26）实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备……………(31)实验十一细胞融合…………………（36）实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本…………（38）实验十三培养细胞的形态观察和计数……………（40）实验十四细胞的原代和传代培养…………………（43）实验十五酸性磷酸酶的显示………（46）实验十六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定……（48）实验十七电镜生物标本的制备及镜下观察………（50）实验十八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察…………（54）实验十九免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原………（56）实验二十姊妹染色单体互换标本制备与分析………（58）实验二十一银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察…………(60)实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察…………（63）实验二十三细胞显微摄影………………（65）附录一离心机转数与离心力的换算表…………………（67）附录二溶液的配制………（68）主要参考资料………………（77）实验室规则一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。实验中途因故需外出时应向任课教师请假。二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。四、必须严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。要爱护仪器、标本和设备。如遇仪器损坏或不灵，应及时报告任课教师，以便修理或更换，不要自行乱修。损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。六、注意节约实验材料、药品和水、电等。七、保持实验室内清洁整齐。实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材清洗后点清数目，然后摆放整齐。班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关和门、窗等，经教师允许后方可离开实验室。八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。常用实验动物的了解和解剖器械的使用一、常用实验动物常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。在医学实验中，常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。例如，蟾蜍可以用于观察离体心脏搏动情况的实验，小白鼠常用于样本很大的实验(如药物的半数致死量的测定等)，猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。蟾蜍蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。1．雌雄鉴别通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l～3趾基部有被称为婚垫的黑疣。2．捉拿及处死方法：常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约l～2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。小白鼠小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。1．捉拿方法：将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。2．处死方法：处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。3．给药方法：小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。二、常用手术器械及操作方法：1．解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。2．解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。3．大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。持法如图。4．眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。5．眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。6．钝头镊子：用于提取脏器、组织等。7．有钩镊子：用于提取皮肤切口等。

常用手术器械

执手术刀的姿势执手术剪的姿势执手术镊的姿势执手术刀、手术剪、手术镊的姿势(张之曾编)

细胞生物学实验绘图方法与要求一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确(注意各部结构的比例关系)。二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。

实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量实验目的制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态，学会使用测微尺，通过测量对红细胞的进化进行分析。实验用品一、材料和标本蟾蜍一只，人血液一滴。二、器材和仪器配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手术器材一套、解剖盘一个、镜台测微尺一个、小平皿一个、牙签。三、试剂1％甲苯胺兰、1％甲基兰、Ringer氏液(两栖类用)。实验内容一、细胞的基本形态观察(一)原理细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。(二)观察方法与结果1．制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用Ringer氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10分钟，盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染成兰紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁(参照照片)。2．蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上，用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维(肌细胞)。尽可能拉直肌纤维。在显微镜下观察，肌细胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边(参照照片)。3．蟾蜍肝脏压片的制备与观察剪开蟾蜍腹腔，取一小块(约2～3mm3)肝放在平皿内，用Ringer氏液洗净，用镊子轻压将肝中的血挤出。然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。染色用甲基兰。显微镜下观察可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形(参照照片)。4．蟾蜍血涂片的制备与观察取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上．将另一载片的一端呈45°角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。(图l一1)。晾干。显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。图1—1血涂片的制备5．人血涂片的制备与观察取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。自细胞数目少，为圆形。6．人口腔上皮细胞标本的制备与观察用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一滴甲苯胺兰染液，染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见复盖口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。二、测微尺的使用(一)原理测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长1毫米(1000μm)，被分为100格，每格长度是10微米。(二)方法1．将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数(图1—2)。

2．按下式求出目镜测微尺每格代表的长度目镜测微尺每格代表的长度(μm)=X10三、测量人口腔上皮细胞从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞核的长短径。作业一、分别求出使用低倍镜(10X)，高倍镜(40X)时目镜测微尺每格代表的长度：低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度=XlO(μm)=μm高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度=XlO(μm)=μm二、分别绘制所观察的6种细胞并注明基本结构。三、计算蟾蜍红细胞的核质比例。计算细胞、细胞核体积的公式：圆形V=4/3πr3(r为半径)椭圆形V=4/3πab2(a、b为长、短半径)核质比N／D=Vn／(Vc—Vn)(Vn为核的体积，Vc是细胞质的体积)实验二线粒体(Mitochondrion)的活体染色及电镜照片观察实验目的掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。实验用品一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml注射器、吸管。三、试剂l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。实验内容一、兔肝细胞线粒体的活体染色（一）原理线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。（二）方法用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。(三)结果显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。二、线粒体的光镜切片观察用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。三．线粒体的电镜照片观察不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。第二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。作业绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。(时伟红编)实验三液泡系(Vacuolarsystem)的活体染色及电镜照片观察实验目的掌握一种活体染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下液泡系的基本形态结构。实验用品一、材料和标本蟾蜍一只，软骨细胞电镜照片。二、器材和仪器光学显微镜一台、手术器材一套、解剖盘一个、载片、盖片、吸水纸。三、试剂l／3000中性红染液、Ringer氏液(两栖类用)。实验内容一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察(一)原理在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。(二)方法取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片，放在载片上，滴两滴1／3000中性红染液，染色8～lO分钟，用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余Ringer氏液。(三)结果显微镜下观察，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色．大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。二、大白鼠胫骺软骨细胞电镜照片的观察动物细胞液泡很小，即使是活体染色也只能看出是一个小点，为了进一步看清液泡的结构我们有必要观察软骨细胞的电镜照片。大白鼠胫骺骨细胞电镜照片，细胞核与核仁很清楚，细胞质中有丰富的粗面内质网，液泡系发达，液泡由单层膜包围，细胞周边有液泡释放。作业绘制光镜下软骨细胞液泡系。(时伟红编)实验四细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的实验观察实验目的掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的基本形态结构。实验用品一、材料和标本盖片培养的成纤维细胞三片。二、器材和仪器光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃三、试剂PBS(pH7.2)、2％TritonX—100液、M—缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮兰染液、100μg／ml的细胞松驰素B、DMEM培养液。实验内容一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应(一)原理微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。（二）细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B4滴继续培养半小时。3.将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。4．对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。5．染色处理①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。②将盖片移入2％TritonX一100液，置37℃③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。④将盖片移入3％戊二醛固定15分钟。⑤将盖片移入0.2％考马斯亮兰染液中，染色15分钟。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。(三)结果光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松驰素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回，多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚台形成微丝，细胞形状恢复正常。二、丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反应(一)原理丽藻细胞大，整个细胞的中央为大液泡占据。靠近液泡是一层溶胶样流动的内质，在内质与质膜之间，为静止的外质，其中含有叶绿体。内质中含有许多颗粒，可以清楚地看到胞质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。成束的微丝出现在外质与内质接口(溶胶和凝胶接口)并交织一起，与环流方向平行。用细胞松弛素B处理后，就可抑制胞质的环流运动。(二)方法1．剪下一小块丽藻叶片(1～2cm)，置于载片上，盖上盖片。2．观察（阳光充足时效果较好）。3．再取一块丽藻叶片，滴一滴细胞松弛素B，10~15分钟后盖上盖片，观察。4．洗去药物，再观察。(三)结果在丽藻内质中可以看到胞质环流，用细胞松弛素B处理后，胞质环流停止，洗去药物，又出现胞质环流。三、微丝的电镜照片观察恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片，可见微丝是实心结构，直径5～8cm，它均匀地分散于细胞基质中，或排列成束和网状。作业绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。(时伟红编)实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察实验目的观察除了实验二～五以外的其它细胞器在光学显微镜和电子显微镜下的基本形态结构。实验内容一、三种细胞器的光镜切片（一）高尔基复合体(GolgiComplex)用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片:神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含有发达的内质网和高尔基复合体，在低倍镜下观察，神经节的假单极细胞体被神经束分隔成群。神经细胞的胞体呈圆形或椭圆形。转换高倍镜观察，细胞中央不着色的圆形区为细胞核。在核的周围有黑褐色颗粒状或呈不规则的条索状结构即为高尔基复合体。图5一l神经节细胞(示高尔基复合体)(二)尼氏小体(Nissl’sBody)甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片，尼氏小体即光镜下的粗面内质网。在低倍镜卡观察，染成蓝色的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞，染色较深的小细胞为神经胶质细胞。转换高倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结构即为尼氏小体。图5—2脊髓前角神经细胞的尼氏小体(三)中心体(Centrosome)铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的外面有卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小粒——中心粒，它与周围致密的细胞质——中心球，组成中心体。转换高倍镜观察，可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体。染色体中心体图5—3马蛔虫受精卵细胞、分裂中期(示中心体)二、六种细胞器的电镜照片（一）高尔基复合体(GolgiComplex)人体胃粘膜细胞高尔基复合体电镜照片：细胞质中有散在的高尔基复合体，其结构要由三部分组成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它们共同构成紧密重叠的囊泡结构。扁平囊约3～8层，它们平行排列，略弯曲成弓形。凸出的一侧为形成面，可见许多小囊泡，凹入的一侧为成熟面，可见扁平囊末端呈球形膨大，在分泌细胞中膨大部分不断脱离扁平囊，形成分泌泡。(二)内质网(EndoplasmicReticulum)人胃壁细胞、恒河猴脊髓前角运动神经细胞粗面内质网电镜照片：粗面内质网在分泌蛋白质的细胞中较发达，在细胞核周围可见有较密集的膜层结构即为粗面内质网，它们大都呈片状排列，粗面内质网可与细胞核膜相通连。在粗面内质网的膜外表面附着许多小颗粒，即核糖体。人胃粘膜盐酸细胞、小鼠睾丸间质细胞滑面内质网电镜照片：盐酸细胞分泌盐酸，细胞中密集的圆泡，无核糖体附着即滑面内质网，参加盐酸的合成。小鼠睾丸间质细胞中含有丰富的分支管状滑面内质网，合成固醇类的雄激素。(三)中心粒(Centriole)白血病细胞的中心粒电镜照片：中心粒是相互垂直的两个短筒状小体，从横切面看，每个短简由9组三联体微管组成。(四)溶酶体(Lysosome)小鼠肝细胞、人胃癌细胞溶酶体电镜照片：溶酶体为一层单位膜包围的囊状结构。溶酶体呈球形，质地均匀，吞噬性溶酶体依结合物不同而呈不同形态，溶酶体主要含酸性水解酶。(五)核糖体(Ribosome)小鼠肾细胞核糖体电镜照片：核糖体是由核糖核酸和蛋白质构成的大小亚基组成的椭圆形颗粒，附着于内质网上的称附着核糖体，此外还有散在于细胞质中的游离核糖体，而多个核糖体由mRNA串连在一起叫多聚核糖体。(六)细胞核(CellNucleus)豚鼠肝细胞核、人胃癌细胞核电镜照片：可见核膜由双层单位膜构成。内外核膜相距一定的距离结合形成核孔。核膜外层也附着核糖体并与内质网相通。核中的海绵状球形结构就是核仁，它由纤维和颗粒构成。在核膜内面和核仁四周，着色较深的为异染色质，其余着色较浅的是常染色质。三、观察恒河猴脊髓前角运动细胞的电镜照片，总结细胞的超微结构照片中是一个多角形的脊髓前角运动细胞，细胞表面以非常细的线条与周围分界，就是细胞膜。中央有圆形的细胞核，核膜密布核孔，核膜内侧少量着色深而致密的是异染色质，色浅的是常染色质。核中央海绵状的一团深色结构是核仁。细胞膜与核膜之间为细胞质。其中有许多膜性结构形成扁平囊状或管泡状，密集成排的膜上附有颗粒，这就是粗面内质网。分散于细胞质中内质网间的许多圆形或棒状膜结构是线粒体。在核的四周可见小泡，扁平囊等集合形成的高尔基复合体。在细胞质中还可见一些不规则形的黑色致密结构是脂褐质，细胞质基质中分散存在纤细的微丝和微管是细胞骨架成份。(时伟红编)实验六细胞生理活动的实验观察实验目的通过制片与观察加深理解细胞的运动、吞噬等生理活动。实验用品一、材料和标本雄性蟾蜍、小白鼠、l％鸡血悬液、6％淀粉肉汤、草履虫。二、器材和仪器光镜、2ml注射器、载玻片、盖玻片、解剖器材、滴管、移液管、试管、玻璃片、黑纸。三、试剂0.3％台盼兰、1％刚果红。实验内容一、细胞的吞噬活动(一)原理白细胞是机体防御系统中能游走的单位。它分为粒细胞系、单核细胞系、淋巴系三类。它们有许多生理功能，如游走性、变形运动、趋化性、吞噬异物等。在白细胞中，以粒细胞、单核细胞的吞噬活动较强，故称此二类细胞为吞噬细胞。单核细胞由血液进入组织后逐渐演变成巨噬细胞。吞噬细胞主要靠吞噬来处理异物。吞噬细胞首先由于趋化作用而向异物游走，然后伸出伪足包围异物，并发生内吞作用形成吞噬泡将异物吞入细胞，继而溶酶体与吞噬泡融合消化异物。(二)小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察l．实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤O．5～1ml(含O．3％台盼兰，起标记作用)，以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞(此步由教师在实验前进行完毕)。2．实验时，每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1％鸡血悬液0．5～1ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。3．1小时后，用颈椎脱位法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹壁，向腹腔注入O．5ml～1ml生理盐水，用牙签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀。4．用注射器抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖片。5．镜检，高倍镜下画图记录所见结果。二、暗视野观察细胞的纤毛和鞭毛运动(一)原理暗视野照明法是一种不使照射被检物体的光线直接进入物镜的照明方法。常常用它来观察没有染色的活体细胞或胶体粒子。利用此照明法，在镜检时不能直接看到通过标本的照明光线，只有被检物体反射或衍射的光线进入物镜可以提高分辨率，在暗视野中可以看到明亮的被检物体的存在和运动，但它们的内部结构却看不清楚。(二)自制遮光板变普通显微镜为“简单的暗视野显微镜”。步骤：1．将显微镜聚光器调到最高位，用低倍镜调焦至清楚。2．取下目镜，从镜筒中观察并调节光圈的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。3．放一块透明玻璃于载物台透光孔上，用尺子测量光圈孔径。4．按照图6--1的形状，用黑纸剪成与调节后光圈孔径一样大小的中央遮光板。5．将中央遮光板放置在显微镜的滤光框上，即可进行标本的暗视野观察。注：如果使用高倍镜观察标本时，应按高倍镜调焦的视野大小重新制作中央遮光板。图6—1中央遮光板a．光圈孔径b．滤光片直径(三)观察蟾蜍上颌粘膜上皮细胞的纤毛运动步骤：1．用捣毁脑脊髓的方法处死蟾蜍。2．腹部向上将蟾蜍固定在蜡盘上。3．沿蟾蜍二侧口角向后剪开约l厘米，将下颌翻转固定在腹部。4．在上颌中线距喉头1厘米处放置腊屑，观察腊屑向什么方向移动？记录腊屑开始移动到消失的时间(见图6--2蟾蜍口腔内面图)。5．然后，用眼科剪刀剪取咽头前部的上颌粘膜约2×2cm2小块，用牙签挑取剪下的粘膜，将纵切面贴于载片上。6．加一滴生理盐水于载玻片标本上，加盖玻片，镜检。图6—2蟾蜍口腔内面图结果：1．在低倍镜下观察上颌粘膜细胞纤毛运动的现象。2．换高倍镜仔细观察纤毛有规律的运动。(四)暗视野观察蟾蜍精子的鞭毛运动步骤：l．将前面实验所用蟾蜍沿腹中线开腹，暴露出黄色圆柱状精巢。2．剪取一侧精巢于盛有自来水的平皿中，用镊子夹住精巢的一端，清洗去血污。3．移取洗净的精巢于另一干净的平皿上，用眼科剪将精巢充分剪碎后，加入数滴自来水混匀。4．用吸管吸取平皿内液体，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，稍待2～3分钟于镜下观察。结果：1．在低倍镜下可见到视野中有许多精子：头部呈长锥形，尾为细长的线状结构。2．置高倍镜下观察：可见有许多靠尾部鞭毛弯曲摆动驱使而运动的精子，测量鞭毛长度。三、草履虫纤毛运动及食物泡的形成图6—3草履虫草履虫是一种单细胞动物。虫体由一个细胞组成，能执行复杂的生理功能。其体表，均匀密布纤毛，为运动细胞器。身体的前部有口沟，由前端斜向伸至体中部，口沟的底部为胞口，下部一短管斜向后部而入胞质，称胞咽。纤毛有规律的摆动使食物在胞咽聚结形成食物泡(吞噬泡)，最后脱离胞咽入胞质。食物泡随细胞质由体后端到前端不停环流，并与溶酶体(含酸性水解酶)融合，行使细胞内消化。根据食物泡中刚果红指示剂的颜色变化(酸性时，为红色；近中性时，为黄色；碱性时，为蓝色)。可以观察到消化过程。实验步骤：1．取一滴草履虫培养液于载玻片上，放上几根棉花纤维，以减慢草履虫的运动。加盖玻片，制成临时装片。2．观察草履虫的运动方式(观察时光线可调暗些)：可见镜下有许多样似倒置鞋底的草履虫，体表纤毛不断摆动，虫体以其中轴左旋前进，若遇阻力则试触后即刻回避而转向。3．观察草履虫的食物泡的形成：1)在盖玻片一侧加一滴l％的刚果红指示剂，用吸水纸从另一侧吸引使指示剂进入盖片下方，选一运动较迟缓的草履虫，移入高倍镜观察吞噬活动。2)几分钟后可见草履虫体内出现许多红色食物泡，随着食物泡不停的在胞质中环流，食物不断消化，泡内酸性减弱或近中性，颜色渐渐呈黄色，食物泡渐小，最后食物泡颜色呈蓝色，不能被消化的残渣，环流到身体后部的胞肛排出，不排出时不易见到胞肛。作业1．画图记录细胞吞噬实验所见结果，小鼠巨噬细胞吞噬实验如何解释细胞内台盼兰的着色？2．在观察细胞纤毛和鞭毛运动实验中,记录一下腊屑从开始运动到消失的时间。3．鞭毛和纤毛有何异同？(朱亚勤编)实验七细胞组分的化学反应实验目的了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。实验用品一、材料和标本蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。二、器材和仪器光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。三、试剂PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)实验内容细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA(一)原理细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。(二)方法l．接种Hela细胞于盖片上并培养24～48小时，使长成单层。2．取出盖片，用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。3．放入Carnoy固定液中固定l小时。4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。5．取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗2～3次(2～3秒钟左右)，吸去水分。放入纯丙酮中分色2～3秒钟。6.放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒钟。7．放入纯二甲苯中透明5分钟。8．滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。9．镜下观察（三）结果细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色（参照照片）。二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示（一）原理由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。（二）方法1．以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。2.将涂片作好标记放在70％乙醇中固定5分钟，室温晾干。3．放入5％三氯醋酸中60℃4．清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。5．滤纸吸干玻片上水分。6.一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色10～15分钟,另一张片放入0.1％酸性固绿(pH2.0～2.5)染色5～10分钟。7．清水冲洗，盖上盖片镜检。（三）结果经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处（参照照片）。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。三、细胞内过氧化物酶的显示（一）原理过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。（二）方法1．取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。2．推片，室温晾干。3．将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒~1分钟。4．取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。5．清水冲洗，放入1％番红溶液中复染2分钟。6．清水冲洗，室温晾干。7．镜检或封片后镜检。（三）结果涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。四、过碘酸雪夫反应(PAS)——显示细胞内糖原(参照照片和示教片)(一)原理组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法来显示，其化学基础是利用过碘酸的氧化作用，打开碳链形成醛，生成的醛基与Schiff试剂中的无色品红反应形成紫红色化合物。(二)方法l．取l~2mm厚的肝组织块，用Carnoy氏液4℃2．乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片。3．用70％乙醇展片。4．脱蜡：二甲苯(1)5分钟→二甲苯(2)5分钟→100％乙醇5分钟→含1％火棉胶的乙醇液1分钟→70％乙醇1分钟。5．直接浸入过碘酸酒精液反应5～15分钟，经70％乙醇洗片刻。6．浸入Schiff氏酒精液反应15分钟。7．亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料。8．流水冲洗3～5分钟。9．蒸馏水洗。10．浸入Ehrlich苏木精复染20~30秒，使细胞核着色。11．脱水：95％乙醇3分钟二次→100％乙醇3分钟二次→二甲苯透明10分钟二次。12．加盖片镜检或树胶封固后镜检。(三)结果细胞中呈紫红的颗粒即为糖原(参照照片)。五、苏丹Ⅲ染色——显示细胞内脂肪(示教片)作业1．

用彩色笔绘出Brachet反应及PAS反应的镜下所见。2．说明着色的碱性蛋白可能是什么物质?(纪晓辉编)实验八细胞核与线粒体的分级分离实验目的通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。实验用品一、材料和标本小白鼠、冰块。二、器材和仪器玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。三、试剂0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。实验内容一、原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。二、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。(二)结果分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。三、高速离心分离提取线粒体(一)操作步骤1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。(二)结果油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。作业1．简要说明分级分离细胞的原理及意义。2．比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的实验结果中纯度如何？2．

描述一下涂片⑤所见结果。

小白鼠

脱颈椎处死，迅速开腹剪取肝组织0.9％NaCl洗涤，称1g剪碎加8ml预冷的0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液匀浆过滤，滤液移入离心管，滤液涂片①离心

普通离心机2500rpm，15分钟滴片滴片詹纳斯绿B染詹纳斯绿B染色④盖片色⑤盖片

镜检油镜检

图8—1细胞核和线粒体分离图解(朱亚勤编)实验九细胞分裂的形态观察实验目的通过标本制备和观察了解生物体细胞的无丝分裂、有丝分裂形态特征及生殖细胞的减数分裂过程。实验用品一、材料和标本蛙血涂片、马蛔虫子宫切片和洋葱根尖切片、固定的蝗虫精巢。二、器材和仪器显微镜、擦镜纸、解剖针、眼科镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养皿、冰箱。三、试剂Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋红染液、45％醋酸、二甲苯。实验内容细胞分裂对生物的个体发育和生存，对种族绵延有着十分重要的意义，高等生物体内细胞的分裂方式有三种：无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。一、动物细胞无丝分裂的观察一蛙血涂片(一)原理无丝分裂不仅是原核生物增殖的方式，而且雷马克(Remak)于1841年最早在鸡胚血细胞中也发现此现象，因为此过程没有出现纺锤丝和染色体的变化，故称无丝分裂(Ami—tosis)。其后无丝分裂又在各种动植物中陆续发现，尤其在分裂旺盛的细胞中更多见，但遗传物质平均分配否?及其分裂的机制尚不十分清楚。蛙红细胞体积较大、数多，而且有核，是观察无丝分裂的较好材料。(二)观察与结果在高倍镜下，可见到处于不同阶段分裂过程中的蛙红细胞，核仁先行分裂，向核的两端移动，细胞核伸长呈杆状；进而，在核的中部从一面或两面向内凹陷，使核成肾形或哑铃形改变；最后，从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞；子细胞较成熟的红细胞小。二、细胞有丝分裂的观察一马蛔虫子宫切片、洋葱根尖切片(一)原理细胞有丝分裂(Mitosis)的现象是分别由弗勒明(Flemming，1882)在动物细胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物细胞中发现。有丝分裂过程包括一系列复杂的核变化，染包体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到每个子细胞的过程。马蛔虫受精卵细胞中只有6条染色体，而洋葱体细胞的染色体为16条，因为它们都具有染色体数目少的特点，所以便于观察和分析。(二)观察1．动物细胞有丝分裂的观察——马蛔虫子宫切片取马蛔虫的子宫切片标本，先在低倍镜下观察，可见马蛔虫子宫腔内有许多椭圆形的受精卵细胞，它们均处在不同的细胞时相。每个卵细胞都包在卵壳之中，卵壳与卵细胞之间的腔，叫卵壳腔。细胞膜的外面或卵壳的内面可见有极体附着。寻找和观察处于分裂间期和有丝分裂不同时期的细胞形态变化，并转换高倍镜仔细观察。图9—1马蛔虫受精卵的有丝分裂间期(Interphase)细胞质内有两个近圆形的细胞核，一为雌原核，另一为雄原核。两个原核形态相似不易分辨，核内染色质分布比较均匀，核膜、核仁清楚，细胞核附近可见中心粒存在。分裂期(Mitosis)前期(Prophase)雌、雄原核相互趋近,染色质逐渐浓缩变粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色体相互混合，两个中心粒分别向细胞两极移动，纺锤体开始形成。中期(Metaphase)染色体聚集排列在细胞的中央形成赤道板，由于细胞切面不同，此期有侧面观和极面观的两种不同现象，侧面观染色体排列在细胞中央，两极各有一个中心体，中心体之间的纺锤丝与染色体着丝点相连；极面观由于染色体平排于赤道面上，六条染色体清晰可数，此时的染色体已纵裂为二，但尚未分离。图9—2洋葱根尖细胞有丝分裂

后期(Anaphase)纺锤丝变短，纵裂后的染色体被分离为两组，分别移向细胞两极，细胞膜开始凹陷。末期(Telophase)移向两极的染色体恢复染色质状态，核膜、核仁重新出现，最后细胞膜横缢，两个子细胞形成。2．植物细胞有丝分裂的观察——洋葱根尖切片将洋葱根尖切片标本先在低倍镜下观察，寻找生长区，这部分的细胞分裂旺盛，大多处于分裂状态，细胞形状呈方形。换高倍镜仔细观察不同分裂时期的细胞形态特征．与动物细胞有丝分裂特征比较，找出植物细胞有丝分裂的特点和两者的区别。三、蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察(一)原理减数分裂(Meiosis)是配子发生过程中的一种特殊有丝分裂，即染色体复制一次，而细胞连续分裂两次，结果使染色体数日减半的过程。减数分裂过程中体现了遗传三定律，所以说减数分裂在稳定种的遗传性状和繁殖中均起着重要作用。蝗虫精巢取材方便，标本制备方法简单，染色体数日较少，例如，蝗虫初级精母细胞染色体数2n=22+X，经过减数分裂形成四个精细胞，每个精细胞的染色体数为n=ll+X或n=11(注：蝗虫的性别决定与人类不同，雌性有两条X染色体、雄性为XO，即只有一条X染色体，没有Y染色体)，一般多采用它来研究观察减数分裂染色体形态变化。(二)蝗虫精巢压片标本的制备l．采集采集到各期分裂相的标本是实验成功的关键，解决这一关键要把握两点(1)时间：沈阳地区采集，一般在8月15至25日为宜；(2)虫体特征：雄虫翘膀长到刚好盖住腹部一半时，正好是雄虫精子发生的峰季，采集最适。在公园、田埂、河边、路旁的草丛中均可采到。2．取材将采到的雄虫，用大头针固定在木板或纸盒上，沿腹部背中线剪开体壁，见消化管背侧的浅黄色结构即是精巢，用镊子分离出来。3．固定把取出的精巢立即放入Carnoy固定液中，固定1小时，在期间用大头针小心分离精细管，加速固定，促进脂肪溶解。固定后移入70％乙醇中存放于4℃4．染色取固定好的精细管2～3条，置于干净载玻片中央，用45％醋酸处理5分钟，用吸水纸吸干后，加1～2滴醋酸洋红染色15分钟。5．压片在染色材料上盖上盖玻片，再在盖玻片上放一块吸水纸，用大拇指垂直在盖玻片上适力下压(压片时不要滑动盖片)使精细管破裂细胞平展开，吸去溢出的染液，即可观察。(三)蝗虫精子发生过程减数分裂的镜下观察(参照照片)蝗虫精巢是由多条圆柱形的精细管组成，每条精细管由于生殖细胞发育阶段的差别可分成若干区，良好压片可见到从游离的顶端起始依次为精原细胞、精母细胞、精细胞及精子等各发育阶段的区域。1．精原细胞(Spermatogonia)位于精细管的游离端，胞体较小，由有丝分裂来增殖，其染色体较粗短、染色较浓。2．减数分裂I(MeioticdivisionI)减数分裂l是从初级精母细胞到次级精母细胞的一次分裂。(1)前期I(ProphaseI)在减数分裂中，以前期I最有特征性、核的变化复杂，依染色体变化，又可分为下列各期：细线期(Leptotenestage)染色体呈细长的丝，称为染色线。弯曲绕成一团，排列无规则，染色线上有大小不一的染色粒，形似念珠，核仁清楚。偶线期（zygotenestage）同源染色体开始配对，同时出现极化现象，各以一端聚集于细胞核的一侧，另一端则散开，形成花束状。粗线期（Pachytenestage）每对同源染色体联合完成，缩短成较粗的线状，称为双价染色体，因其由四条染单体组成，又叫四分体。双线期(Diplotenestage)染色体缩的更短些，同源染色体开始有彼此分开的趋势，但因两者相互绞缠，有多点交叉，所以这时的染色体呈现麻花状。终变期(Diakinesis)染色体更为粗短，形成Y、V、O等形状，终变期末核膜、核仁消失。(2)中期I(MetaphaseI)核膜和核仁消失，纺锤体形成，双价染色体排列于赤道面，着丝点与纺锤丝相连。这时的染色体组居细胞中央，侧面观呈板状，极面观呈空心花状。(3)后期I(AnaphaseI)由于纺锤丝的解聚变短，同源的两条染色体彼此分开，分别向两极移动。但每条染色体的着丝粒尚未分裂，故两条姐妹染色单体仍连在一起同去一极。（4）末期I(TelophaseI>移动到两极的染色体，呈聚合状态，并解旋，同时核膜形成，胞质也均分为二，即形成两个次级精母细胞，这时每个新核所含染色体的数目只是原来的一半。到此减数分裂I结束。3．减数分裂Ⅱ(MeioticdivisisonⅡ)减数分裂Ⅱ类似一般的有丝分裂，但从细胞形态上看，可见胞体明显变小，染色体数目少。(1)前期Ⅱ(ProphaseⅡ)末期I的细胞进入前期Ⅱ状态，每条染色体的两个单体显示分开的趋势，染色体象花瓣状排列，使前期Ⅱ的细胞呈实心花状。(2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)纺锤体再次出现，染色体排列于赤道面。(3)后期Ⅱ(AnaphaseⅡ)着丝粒纵裂，每条染色体的两条单体彼此分离，各成一子染色体，分别移向两极。(4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到两极的染色体分别组成新核，新细胞的核具单倍数(n)的染色体组，胞质再次分裂，这样，通过减数分裂每个初级精母细胞就形成了四个精细胞。4．精子形成在两次精母细胞分裂过程中，各种细胞器，如，线粒体、高尔基体等也大致平均地分到四个精细胞中，精细胞经一系列的分化成熟为精子。镜下精子头部呈梭形，由细胞核及顶体共同组成，尾部细长呈线状。作业一、说明动植物细胞有丝分裂的区别。二、绘制马蛔虫受精卵有丝分裂的各期细胞图像，并注明结构名称?三、小结有丝分裂与减数分裂过程的异同点。(谢荣林编)实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备实验目的掌握微量全血培养及正常细胞和肿瘤细胞常规核型的标本制备技术。了解正常及肿瘤细胞核型的一般特征。实验用品一、材料和标本健康人的外周血、培养的HeLa细胞和HL—60细胞。二、器材和仪器超净台、煤气灯、乳胶管、火柴、镊子、废液缸、离心机、水浴箱、定时钟、天平、离心管(10m1)、乳头吸管、显微镜、载玻片、平皿等。无菌器材有培养瓶、培养皿、注射器(5ml、lml)、注射针头(7号、号)、刻度移液管(5ml、2ml、lml)、吸管等。三、试剂1640培养液、500单位／ml的肝素溶液、10μg／ml的秋水仙素溶液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液,O．5mg／ml的PHA溶液、0.075mol／L的KCl溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液(pH6.8)、生理盐水等。实验内容一、微量全血培养(一)原理人体外周血中淋巴细胞是成熟的免疫细胞，正常情况下处于G。期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它动物淋巴细胞的有丝分裂刺激剂，它能使处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进入细胞周期开始旺盛的有丝分裂。人体微量全血培养是一种简单的淋巴细胞培养方法。此法采血量少、操作简便，在PHA作用下进行短期培养即可获丰富的、有丝分裂活跃的淋巴母细胞，适于制备核型标本。各种因素的效应(如病毒、电离辐射、化学药剂等)也可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而进行多种在体内无法进行的研究。因此它是细胞生物学及其它学科研究中的一种有效的方法。(二)操作1．打开超净台紫外灯20～30分钟。洗手、换洁净白大衣后进入操作室。启动超净台，点燃煤气灯。用75％酒精棉球擦洗手、各种试剂瓶及操作台面，然后将培养液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超净台。2．在超净台内将每个培养瓶装入5ml培养液及0.2mlPHA溶液，封好备用。3．用5ml注射器，7号针头，先吸取少许肝素湿润针筒，然后从肘静脉抽血l～2ml。每个培养瓶接种全血O．2ml左右轻轻摇动使血和培养液混匀。4．在培养瓶上标记好供血者姓名、性别、采血日期等，放入培养箱中37℃二、人淋巴细胞染色体标本制备(一)原理在淋巴母细胞分裂高峰时加入秋水仙素，破坏细胞纺锤体的形成，使细胞停止在分裂中期。然后收集细胞，低渗处理，使细胞胀大，染色体伸展。接着进行固定并除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。再结合离心技术去掉红细胞碎片，然后采用空气干燥法制片获得中期染色体标本。(二)操作1．微量全血细胞培养至68小时左右，用1ml注射器号针头向每个5ml培养瓶内加2滴秋水仙素溶液，摇匀后继续培养3小时，此项操作不需要严格无菌。2．按时终止培养，用吸管温和吹打成细胞悬液后，移至10ml离心管中。用天平平衡后以1000rpm离心8分钟，弃大部上清，剩0.5ml。再吹打成细胞悬液，加入预热37℃的0.075mol／L的KCL溶液9ml，置373.向离心管中加入1ml固定液预固定。平衡后以1000rpm离心8分钟，同样剩0.5ml上清。4．轻轻将细胞吹成悬液，加5~6ml固定液，室温下固定30分钟。然后离心，弃上清，重复固定一次。再离心，留0.1～0.2ml上清，吹打成细胞悬液。5．吸取1～2滴悬液，在距载片约15cm高度滴于预冷的干净载玻片上，迅速对准细胞吹气促进染色体分散。斜放载玻片，在空气中晾干(此期间配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸缓冲液1:10)。6．将标本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分钟，自来水冲洗，晾干后观察。(三)结果低倍镜下，制片质量较好的标本上可看到有较多的分裂相，染色体之间分散良好，互不重叠。油镜下观察可见每一条染色体都含有两条染色单体，两条单体由着丝粒相结。分区计数染色体数目并判定性别，或拍照后进行核型分析。三、肿瘤细胞的染色体标本制备(一)原理利用肿瘤细胞无限繁殖的特点，掌握其体外生长动态，取处于对数生长期的细胞便可获得丰富的分裂相。肿瘤细胞染色体异常包括两个方面：1．结构异常即在肿瘤细胞常出现的染色体畸变，包括双着丝点染色体、环状染色体、断裂的染色体、染色体裂隙及微小体等。2．数目异常由于肿瘤细胞分裂失去应有的调控，可出现亚二倍体、超二倍体和多一倍体数目异常现象。肿瘤细胞染色体制备技术在细胞生物学、医学遗传学的基础研究和临床诊断、愈后观察等方面均有广泛用途。(二)操作l．以1.6×105个／ml细胞浓度将FL—60细胞接种于培养瓶内，48小时后以终浓度为0.04μg／ml的秋水仙素处理2.5小时，移入10ml离心管。其余步骤与淋巴细胞染色体制备相同。2.将长成单层的HeLa细胞按1:2传代进行培养，36小时后用终浓度为0.04μg／ml的秋水仙素处理3小时。按时终止培养，用0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液处理单层细胞，待细胞收缩变圆时，弃去消化液。加入少许低渗液将细胞从瓶壁洗脱，移入10ml离心管，加入预热37℃的低渗液至5~6ml，在37(三)结果计数HeLa细胞和HL—60细胞的染色体数并寻找是否有畸变的染色体。附：人体染色体常规核型的分析一、人体染色体的观察取制备较好的染色体玻片标本，先在低倍镜下观察。在标本中选择一个染色体之间分散较好，互不重叠的中期分裂相，置于视野中央，然后换油镜仔细观察。每个染色体都含有两条染色单体，两单体连接处为着丝粒。计数时要把分散的染色体划分为几个区域以免计数重复或遗漏，然后计数并判定性别。二、核型分析的方法人体染色体常规核型的分析，在今天的染色体研究水平上作为染色体结构异常的疾病诊断已经失去意义，但对染色体数目异常仍具有诊断上的价值，尤其是起着分析其它几种显带核型的桥梁作用。通过常规核型的分析必须掌握三点：(一)会分组、(二)了解各组染色体的基本形态特征、(三)会计数数目和鉴定性别。人体染色体的常规核型即按照Denver会议(1960年)提出的染色体命名和分类标准，将人类体细胞的46条染色体按大小、着丝点的位置分成七组(A、B、C、D、E、F、G、)23对的排列。七组染色体的基本形态特征及分析顺序是：A组是七组染色体中最大的一组，首先找出它。A组包括三对，即第1~3号6条染色体，第1号为最大、是中央着丝点，长臂近侧有次缢痕；第2号第二大、着丝点略偏离中央；第3号为三大，是中央着丝点。接着确定B组：B组二对即第4～5号4条染色体，较大，均为亚中着丝点，两者不易区分开。第三确定D组和G组：D组三对即第13～15号6条染色体，中等大小均为近端着丝点，短臂末端有随体。G组二对即第21～22号4条染色体，是最小的一组，均为近端着丝点，短臂末端有随体，长臂常呈分叉状，21号稍小于22号。Y染色体被隶属于该组，短臂无随体，一般较2l、22号大点。第四确定F组：F组二对即第19～20号4条染色体，染色体比G组稍大、均为中央着丝点。染色体分组形态特征表第五确定E组：E组三对即第16～18号6条染色体，较小，第16号是中央着丝点，17、18号是亚中着丝点。余者为C组：C组七对即第6～12号14条染色体，按大小顺序依次排列，均是亚中着丝点；X染色体被隶属该组，大小居6～7号之间，是亚中着丝点。上述人的常规核型中，1～22号为常染色体，男女共有，另一对为性染色体，决定性别，男性为XY，女性为XX，人的正常核型写法：男46，XY；女46，XX。图15—1各组染色体基本形态特征的模式图作业一、计数HeLa和HL一60细胞的染色体数，它们各属哪种数目异常?二、分析制备好的正常人外周血淋巴细胞染色体，判断其性别。三、要想制备出好的染色体标本应该注意哪些环节?谈谈自己实验成功或失败的体会。(王明武编)实验十一细胞融合实验目的掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。实验用品一、材料鸡红细胞二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片三、试剂50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)实验内容一、原理细胞融合(Cellfusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。二、方法(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5mlHanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37℃(5)缓慢滴加9mlHanks液以终止PEG的作用，在37℃(6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。三、结果观察在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。四、融合率的计算在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：作业l．在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。2．你测定的细胞融合率为多少?(张之曾编)实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本实验目的通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。实验用品一、材料人宫颈癌上皮细胞(HeLa细胞)二、器材和仪器显微镜、离心机、水浴箱、热吹风机、10ml刻度离心管、5针头注射器、试管架、染色槽、废液缸、吸水纸、擦镜纸、冰冻载玻片、香柏油瓶、记号笔、酒精灯。三、试剂50％PEG、Hanks液(pH7.4)、RPMI一1640培养基(含10％灭活小牛血清，pH